JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:55 min. • July 8th, 2025
Fissare una fetta di cervello di topo in una camera di registrazione, perfusa con aCSF ossigenato dopo un'incubazione prolungata.
Le cellule della fetta sono caricate con un indicatore di calcio, che facilita le misurazioni intracellulari del calcio.
Prelevare una pipetta di registrazione comprendente un elettrodo in una soluzione elettrolitica.
Identificare un neurone bersaglio. Posizionare la pipetta di registrazione con una pressione positiva sulla membrana cellulare, creando una fossetta.
Applicare una pressione negativa per creare una tenuta ermetica.
Inoltre, applicare impulsi a pressione negativa, rompendo la membrana e stabilendo una configurazione dell'intera cellula.
Perfondere aCSF con un'alta concentrazione di potassio, che depolarizza la membrana del neurone.
La depolarizzazione apre i canali del sodio, innescando un potenziale d'azione, che a sua volta attiva i canali del calcio voltaggio-dipendenti e consente l'afflusso di calcio.
Gli ioni calcio si legano all'indicatore, migliorando la fluorescenza, che può essere visualizzata con un'illuminazione adeguata.
L'aumento della fluorescenza intracellulare, causato dall'afflusso di calcio in seguito all'applicazione di potassio, indica la vitalità neuronale dopo un'incubazione prolungata.
Per la registrazione, posizionare il tessuto in una camera di registrazione sommersa al microscopio e perfonderlo con aCSF ossigenato a una velocità di flusso da 4 a 5 millilitri al minuto. Trattieni il fazzoletto usando un'arpa su misura. Successivamente, preparare alcune pipette di registrazione utilizzando un estrattore per micropipette per ottenere una resistenza finale da 5 a 6 mega ohm.
Riempi la pipetta con 3 o 4 microlitri di soluzione interna, quindi metti la soluzione sul ghiaccio. Quindi, visualizza le celle utilizzando una telecamera CCD in IR-DIC. Posizionare la pipetta sulla membrana cellulare utilizzando un micromanipolatore. Mantenere la pressione positiva attraverso una porta di aspirazione sul supporto della pipetta. Una volta che la pipetta è sulla cellula, applicare una leggera pressione negativa sulla pipetta per ottenere una tenuta gigaohm.
Quindi, rompere la membrana cellulare con una breve pressione negativa. Successivamente, avviare la registrazione della corrente o del morsetto di tensione dell'intera cella. Per una singola lunghezza d'onda di eccitazione del flusso 4, filtrare la luce di eccitazione attraverso un filtro passa-banda da 460 a 490 nanometri e la luce emessa attraverso un filtro passa-banda da 515 a 550 nanometri.