JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:11 min • July 8th, 2025
Posizionare una capsula di Petri contenente una larva di Drosophila sezionata con muscoli e rami nervosi esposti sul tavolino del microscopio.
Inserire un elettrodo di riferimento in una soluzione da bagno all'interno della piastra di Petri.
Riempire un elettrodo di registrazione con una soluzione isotonica.
Utilizzando un micromanipolatore, posizionare questo elettrodo su un muscolo addominale innervato dai motoneuroni.
Posizionare la punta dell'elettrodo su un bottone sinaptico, una struttura sulla punta dell'assone contenente neurotrasmettitori.
Registra continuamente correnti giunzionali eccitatorie in miniatura o mEJC, che sono risposte al rilascio spontaneo di neurotrasmettitori.
L'intervallo corretto dell'ampiezza mEJC conferma il corretto posizionamento dell'elettrodo.
Quindi, posizionare un elettrodo di stimolazione vicino all'assone che innerva il muscolo bersaglio.
Applicare una pressione negativa per tirare l'assone all'interno dell'elettrodo.
Aumentare gradualmente la corrente di stimolazione per indurre un potenziale d'azione.
Questo innesca l'assone a rilasciare neurotrasmettitori alla giunzione neuromuscolare, che vengono registrati come correnti sinaptiche.
Posizionare la capsula di Petri con il preparato sul tavolino da microscopio. Inserire l'elettrodo di riferimento nella vasca. Riempire l'elettrodo di registrazione con la soluzione HL3. Sotto l'obiettivo 10x, immergere l'elettrodo nella vasca e posizionarlo sui muscoli sei e sette dei segmenti addominali 2, 3 o 4 utilizzando il micromanipolatore.
Quindi, cambia l'obiettivo su 60X e metti a fuoco l'area di interesse utilizzando l'epi-florescenza o l'ottica DIC. Posizionare la punta dell'elettrodo sopra i bottoni sinaptici, quindi premere l'elettrodo molto delicatamente sul muscolo poiché una pressione eccessiva può danneggiare l'NMJ o indurre un aumento dell'attività sinaptica spontanea.
Quindi, accendi l'amplificatore, la scheda AD e il computer. Quindi, scegli la modalità di morsetto di tensione sull'amplificatore. Avviare il software di acquisizione, scegliere la modalità Gap-free e osservare l'aspetto delle mEJC sullo schermo del computer. Assicurarsi che l'ampiezza delle mEJC sia compresa tra 0,2 e 0,7 nanoampere.
Utilizzando un micro-manipolatore sotto controllo visivo, posizionare l'elettrodo di stimolazione vicino all'assone che innerva i segmenti addominali da 2 a 4. Applicare una pressione negativa tirando il pistone della siringa collegata al portaelettrodo, in modo che l'assone venga tirato all'interno dell'elettrodo.
Quindi accendi lo stimolatore. Ruotare la manopola sull'unità di isolamento per impostare una corrente zero, quindi aumentarla delicatamente fino a visualizzare le EJC o fino al raggiungimento della soglia. Eseguire la stimolazione in un regime soprasoglia, con la corrente di stimolazione aumentata di circa il doppio rispetto alla soglia per l'osservazione delle EJC.