JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:43 min. • July 8th, 2025
Iniziare con le cellule endoteliali vascolari cerebrali o CVE nei terreni di coltura.
Le cellule CVE sono cellule ad alto consumo energetico che rivestono i vasi sanguigni del cervello e sono essenziali per la fisiologia del cervello.
Posizionare le cellule in una piastra di coltura cellulare a flusso extracellulare. Incubare per l'attacco cellulare.
Sostituire il terreno di coltura con un terreno di coltura per il saggio del flusso extracellulare con il pH desiderato.
Incubare senza anidride carbonica per mantenere il pH.
Quindi, prendi una cartuccia del sensore di flusso extracellulare, che include sensori e una piastra inferiore.
Aggiungere una soluzione di calibrazione alla piastra e incubare senza anidride carbonica per idratare i sensori.
Questi sensori possono misurare le variazioni della concentrazione di ossigeno nell'ambiente extracellulare, indicative dell'attività mitocondriale.
Quindi, caricare la cartuccia in una macchina bioanalizzatrice e calibrare i sensori.
Sostituire la piastra inferiore con la piastra contenente le celle.
Misurare la funzione mitocondriale delle cellule CVE.
Dopo aver raggiunto il numero appropriato di sottocolture, seminare 1,6 x 104 cellule in 80 microlitri di terreno completo per pozzetto su una piastra di coltura cellulare a flusso extracellulare da 96 pozzetti e posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Il giorno prima del test di valutazione funzionale mitocondriale, idratare una cartuccia del sensore di flusso extracellulare con 150 microlitri di soluzione calibrante di flusso extracellulare e incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica.
La mattina successiva, utilizzare la stazione di lavaggio delle piastre per trasformare il terreno di coltura cellulare in un terreno di saggio del flusso extracellulare a pH 7.0, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica per 30-60 minuti. Quando le cellule si sono equilibrate, caricare la cartuccia idratata nel bioanalizzatore e fare clic sul pulsante Avvia per iniziare la calibrazione.
Al termine della calibrazione, fare clic sul prompt Sblocca cartuccia per rimuovere la piastra inferiore della cartuccia e caricare la piastra cellulare, quindi aprire il file di dati per ottenere i valori di velocità dal bioanalizzatore per l'esportazione nel file del foglio di calcolo.