JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:34 min. • July 8th, 2025
Prendi una fetta coronale dell'organo vomeronasale chemiosensoriale da un topo transgenico che esprime neuroni sensoriali marcati in fluorescenza.
L'epitelio sensoriale contiene questi neuroni marcati, che sono esposti al lume collegato alla cavità nasale per rilevare i segnali chimici.
Fissare la fetta in una camera di imaging utilizzando un'ancora a fetta.
Trasferire la camera in una configurazione di registrazione e far fluire una soluzione extracellulare ossigenata per mantenere la vitalità dei tessuti.
Posizionare una pipetta di perfusione vicino alla fetta per introdurre stimoli chimici e una pipetta di registrazione sui neuroni sensoriali.
Utilizzando un microscopio a fluorescenza, identificare i neuroni marcati.
Applicare una pressione positiva per evitare l'intasamento della pipetta e avvicinarsi a un neurone fino a quando non si forma una fossetta sulla membrana.
Passare alla pressione negativa, aspirando la membrana nella pipetta.
Applicare l'aspirazione per rompere la membrana e stabilire la continuità con il citoplasma, chiamata patch clamp a cellula intera, consentendo l'introduzione di stimoli chimici e registrando i segnali elettrofisiologici risultanti.
Trasferire una fetta di VNO nella camera di imaging e fissare la posizione della fetta utilizzando un ancoraggio in acciaio inossidabile cablato con fibre sintetiche spesse 0,1 millimetri. Non coprire la fetta di tessuto con nessuno dei fili di fibra sintetica. Quindi, trasferire la camera di imaging nella configurazione di registrazione e sovrafondere continuamente la fetta con S2 ossigenato a temperatura ambiente.
Regolare il capillare di aspirazione sulla superficie della soluzione per creare uno scambio costante della soluzione del bagno. Quindi, regolare la matita per perfusione multi-barile 8 in 1 sopra e vicino alla parte non sensoriale della fetta VNO che contiene il vaso sanguigno. Successivamente, collegare l'elettrodo di riferimento e la soluzione del bagno utilizzando il ponte agar a forma di L riempito con 150 millimolari di cloruro di potassio.
Successivamente, riempire la pipetta patch con la soluzione per pipette S4. Montare la pipetta sull'elettrodo rivestito di cloruro d'argento collegato allo stadio superiore senza raschiare il rivestimento e fissarla saldamente. Quindi, applicare una leggera pressione positiva sulla pipetta per cerotti prima di entrare nella vasca. Monitorare la pipetta e assicurarsi che sia compresa tra quattro megaohm e 10 megaohm.
Visualizza la fetta di VNO con una telecamera CCD utilizzando DIC ottimizzato per gli infrarossi e identifica le cellule che esprimono FPR-rs3-i-Venus o neuroni marcati in modo simile utilizzando l'illuminazione a fluorescenza e un cubo filtro appropriato. Avvicinati al corpo cellulare usando i volantini per la massima sensibilità. A causa della pressione positiva, una piccola ammaccatura sulla membrana del soma cellulare diventa visibile, una volta che la punta della pipetta si trova nelle immediate vicinanze.
Quindi, rilasciare la pressione positiva e applicare una leggera pressione negativa per aspirare la membrana cellulare, al fine di ottenere una tenuta ad alta resistenza da 1 a 20 giga-ohm. Successivamente, applicare un'aspirazione breve e delicata per interrompere la membrana cellulare e stabilire la configurazione dell'intera cellula.