Registrazione dell'attività elettrofisiologica della rete neuronale in una co-coltura neurone-astrocitaria

Inizia con una piastra MEA (Multi-Electrode Array). Ogni pozzetto contiene una serie di elettrodi posizionati centralmente.

L'array è rivestito con un substrato di coltura per facilitare l'adesione cellulare.

Aggiungere una sospensione di motoneuroni e astrociti come gocciolina sopra l'array.

Incubare per consentire l'adesione delle cellule, quindi aggiungere un terreno di co-coltura caldo integrato con una piccola molecola che mantiene la vitalità cellulare.

Durante l'incubazione, gli astrociti secernono fattori che promuovono la maturazione neuronale e la formazione delle sinapsi, dando vita a una rete neuronale.

Posizionare il MEA in un dispositivo di registrazione in condizioni fisiologiche per monitorare l'attività neuronale.

I neuroni trasmettono segnali elettrici, chiamati potenziali d'azione, che viaggiano lungo i loro assoni.

Una volta raggiunta la sinapsi, il segnale innesca il rilascio del neurotrasmettitore, propagando il segnale al neurone successivo.

Gli elettrodi all'interno di ciascun pozzetto registrano extracellulare i segnali generati dai neuroni connessi sinapticamente.

La rilevazione di segnali elettrici ritmici sincronizzati conferma la creazione di una rete neuronale.

Il giorno della placcatura o prima, iniziare a rivestire le piastre MEA a 24 pozzetti diluendo prima il PLO in acqua o PBS. Quindi, aggiungere da 15 a 20 microlitri di PLO in ciascun pozzetto, formando una gocciolina al centro del pozzetto, coprendo l'area dell'elettrodo, assicurandosi di non danneggiare gli elettrodi con la punta della pipetta.

Aggiungere acqua ai pozzetti circostanti i compartimenti, garantendo un'umidità sufficiente, e incubare l'OLP a 37 gradi Celsius per 1 o 2 ore. Quindi, utilizzando una punta per micropipetta in plastica, aspirare quanto più PLO possibile senza toccare gli elettrodi. Successivamente, lavare il pozzo con 250 microlitri di acqua, tre volte.

Utilizzando la punta di una pipetta, rimuovere quanta più acqua possibile e lasciare asciugare la superficie con il coperchio rimosso. Quindi, aggiungere da 15 a 20 microlitri di laminina diluita per coprire ogni array di elettrodi. Dopo aver aggiunto acqua agli scomparti per l'umidità e riposizionato il coperchio, incubare a 37 gradi Celsius per un minimo di due ore fino a tutta la notte.

Il giorno della piastratura, dopo aver risciacquato una volta i motoneuroni e le colture di astrociti con PBS, aggiungere lo 0,05% di tripsina e incubare a 37 gradi Celsius per circa 5 minuti per sollevare le cellule. Raccogli le cellule in una provetta conica da 15 millilitri, contenente un inibitore della tripsina, e lava le piastre con terreno o base per assicurarti che tutte le cellule siano raccolte.

Pellettare le cellule mediante centrifugazione e quindi utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri, risospendere i motoneuroni e gli astrociti con un terreno di co-coltura contenente 20 micromolari di inibitore ROCK per generare 1 millilitro di una sospensione a singola cellula. Utilizzando un emocitometro, contare i motoneuroni e gli astrociti e, durante il conteggio, tappare le sospensioni cellulari e posizionarle in una rastrelliera di polistirolo a 4 gradi Celsius.

Centrifugare 1 millilitro di entrambe le sospensioni cellulari a 300 volte g per 5 minuti. Calcolare il volume desiderato e risospendere i pellet. Combinare il volume richiesto di sospensioni di neuroni e astrociti in rapporti uguali e mescolare delicatamente pipettando due volte per ottenere una combinazione completa.

Quindi, rimuovere la laminina da ciascun pozzetto della piastra e trasferire 10 microlitri della sospensione cellulare combinata finale in ciascun pozzetto, formando una piccola gocciolina che copre l'array di elettrodi. Incubare le piastre con una gocciolina cellulare indisturbata a 37 gradi Celsius per 20-30 minuti per formare gli attacchi iniziali sulle piastre.

Quindi, pipettare 250 microlitri di terreno di co-coltura caldo contenente l'inibitore ROCK sulla parete di ciascun pozzetto, pipettare lo stesso volume sulla parete opposta di ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 24-36 ore. Il giorno successivo, esaminare le piastre per verificare la presenza di detriti o cellule morte e, se necessario, sostituire il terreno con un terreno di co-coltura fresco contenente inibitore ROCK.

In caso contrario, eseguire scambi semi-terreno due volte a settimana utilizzando un terreno di co-coltura senza un inibitore ROCK, a partire dal giorno 2 di co-coltura. Per eseguire la registrazione, iniziare il prima possibile dopo il giorno 1 di co-coltura impostando la temperatura a 37 gradi Celsius e l'anidride carbonica al 5%. Quindi, trasferire le lastre alla macchina di registrazione ed equilibrarle per almeno cinque minuti prima di registrare. Registrare l'attività di base a giorni alterni o settimanalmente per un periodo compreso tra 1 e 15 minuti, a seconda del disegno sperimentale.