Misurazione simultanea del calcio intracellulare e del potenziale di membrana in un endotelio cerebrale di topo

Prendi segmenti di un'arteria cerebrale posteriore di topo.

Incubare con una soluzione enzimatica per degradare la matrice tissutale, allentando le cellule.

Sostituire la soluzione con un tampone, quindi trasferire un segmento in una camera di registrazione.

Dissociare meccanicamente il tessuto connettivo e gli strati delle cellule muscolari lisce, isolando il tubo endoteliale sottostante.

Fissare la provetta, rimuovere gli strati dissociati e aggiungere un tampone fisiologico.

Collocare la camera all'interno di un sistema di registrazione con flusso tampone continuo.

Introdurre un indicatore di calcio fluorescente che entra nelle cellule endoteliali, quindi inserire un elettrodo di registrazione in una cellula.

Somministrare un farmaco che innesca l'afflusso di ioni calcio e induce la segnalazione a valle per il rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico.

L'indicatore si lega al calcio e, dopo l'eccitazione, emette fluorescenza.

L'aumento del calcio attiva i canali del potassio calcio-dipendenti, causando il deflusso di potassio e alterando il potenziale di membrana.

Registrare simultaneamente le variazioni del calcio intracellulare tramite il segnale fluorescente e il potenziale di membrana utilizzando l'elettrodo.

In questa procedura, preparare l'apparato di triturazione utilizzando un microscopio, una fotocamera e un tavolino in alluminio contenente una camera e micromanipolatori. Fissare una microsiringa con un controller della pompa adiacente allo stadio e al campione. Quindi, riempire completamente una pipetta di triturazione con olio minerale e fissarla sul pistone della microsiringa.

Quindi, utilizzando la microsiringa con controller della pompa, prelevare circa 130 nanolitri di soluzione di dissociazione nella pipetta assicurandosi dell'assenza di bolle d'aria. Successivamente, posizionare i segmenti arteriosi intatti in un millilitro di soluzione di dissociazione con le concentrazioni richieste di enzimi in una provetta di vetro da 10 millilitri.

Incubare a 34 gradi Celsius per 10-12 minuti per una digestione parziale. Dopo la digestione, sostituire la soluzione enzimatica con 5 millilitri di soluzione di dissociazione fresca. Utilizzando una pipetta da 1 millilitro, trasferire un segmento nella camera contenente la soluzione di dissociazione a temperatura ambiente.

Quindi, posizionare la pipetta nella soluzione di dissociazione nella camera e posizionarla vicino a un'estremità del recipiente digerito. Impostare una velocità compresa tra 2 e 5 nanolitri al secondo sul controller della pompa per una triturazione delicata. Durante la visualizzazione attraverso un ingrandimento da 100 a 200 volte, ritirare ed espellere il segmento arterioso per dissociare le cellule muscolari lisce producendo un tubo endoteliale.

Se necessario, utilizzare con cautela una pinza a punta fine per separare l'avventizia dissociata e la lamina elastica interna dal tubo endoteliale. Confermare che tutte le cellule muscolari lisce siano dissociate e che solo le cellule endoteliali rimangano intatte come tuba.

Utilizzando micromanipolatori, fissare ciascuna estremità del tubo endoteliale sul vetrino coprioggetto della camera di superfusione utilizzando pipette di fissaggio in vetro borosilicato. Lavare via l'avventizia dissociata e le cellule muscolari lisce dalla camera e sostituire la soluzione di dissociazione con due millimolari di cloruro di calcio PSS.

Trasferire la piattaforma mobile fissata al tubo endoteliale sul microscopio di superfusione e sul banco sperimentale. Quindi, utilizzare sei serbatoi puliti da 50 millilitri per l'erogazione continua di PSS e rispettive soluzioni farmacologiche durante l'esperimento.

Utilizzare la valvola di controllo del flusso in linea per impostare manualmente la portata in modo coerente come il flusso laminare, abbinando l'alimentazione del flusso all'aspirazione del vuoto. Somministrare PSS alla camera per la superfusione del tubo endoteliale per almeno cinque minuti prima di registrare i dati di fondo e il carico del colorante.

Per misurare il potenziale di membrana contemporaneamente alla concentrazione intracellulare di calcio, tirare un elettrodo affilato e riempirlo con due molari di cloruro di potassio per registrare dalle cellule caricate con il colorante Fura-2.

Per studiare l'accoppiamento intercellulare tramite trasferimento di colorante, riempire il microelettrodo con ioduro di propidio allo 0,1% disciolto in due molari di cloruro di potassio. Quindi, posizionare l'elettrodo su un filo d'argento rivestito di cloruro nel portapipette collegato a uno stadio della testa dell'elettrometro fissato con un micromanipolatore.

Utilizzare il micromanipolatore per posizionare brevemente la punta dell'elettrodo nel PSS che scorre nella camera mentre si osserva attraverso l'obiettivo a quattro tempi. Successivamente, impostare il potenziale della membrana a riposo su zero in modo coerente con il potenziale del bagno a terra.

Se lo si desidera, utilizzare monitor acustici di base collegati a elettrometri per associare l'altezza del suono a potenziali registrazioni. Successivamente, aumentare l'ingrandimento a 400 volte utilizzando un obiettivo 40 volte e posizionare la punta dell'elettrodo appena sopra una cella del tubo endoteliale.

Regolare la finestra fotometrica utilizzando il software di fotometria per concentrarsi su circa 50-80 cellule endoteliali. Quindi, posizionare delicatamente l'elettrodo in una delle cellule del tubo endoteliale utilizzando il micromanipolatore e attendere almeno due minuti affinché il potenziale della membrana a riposo si stabilizzi.

Una volta che il potenziale di membrana a riposo è stabile al suo valore atteso, accendere il tubo fotomoltiplicatore sull'interfaccia di fluorescenza in assenza di luce e iniziare l'acquisizione della concentrazione intracellulare di calcio eccitando Fura-2, alternativamente, a 340 e 380 nanometri mentre si raccoglie l'emissione di fluorescenza a 510 nanometri.

Una volta stabilite le misurazioni simultanee del potenziale di membrana e della concentrazione intracellulare di calcio, attendere circa cinque minuti per la superfusione del tubo endoteliale con PSS a una velocità di flusso laminare costante prima dell'applicazione dei farmaci.

Applicare il farmaco preparato in PSS nella camera di superfusione a portata costante. Durante il trattamento farmacologico, misurare contemporaneamente il potenziale di membrana nel rapporto F340/F380. Una volta terminato l'esperimento, estrarre l'elettrodo dalla cella. Quindi, interrompere le rispettive registrazioni del potenziale di membrana e della concentrazione intracellulare di calcio e salvare i file per l'analisi dei dati.