JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:17 min. • July 8th, 2025
Porre un vetrino coprioggetti contenente una co-coltura in una camera di registrazione perfusa con una soluzione extracellulare ossigenata.
La co-coltura è costituita da astrociti, neuroni corticali di ratto che esprimono canali ionici sensibili alla luce fusi a una proteina fluorescente e neuroni derivati da iPSC che esprimono un'altra proteina fluorescente.
Utilizzando un microscopio confocale, identificare un neurone fluorescente derivato da iPSC.
Far avanzare una pipetta di registrazione riempita con una soluzione intracellulare verso il neurone per stabilire una configurazione dell'intera cellula.
Mantenere costante il potenziale negativo della membrana per misure accurate della corrente.
Illuminare la co-coltura con la luce per attivare i canali ionici sensibili alla luce nei neuroni corticali, generando così un potenziale d'azione.
Il potenziale d'azione provoca il rilascio di neurotrasmettitori nella fessura sinaptica.
Se connessi sinapticamente, i neurotrasmettitori si legano ai recettori sul neurone derivato da iPSC patchato, aprendo i canali ionici e generando correnti postsinaptiche.
L'aumento delle correnti postsinaptiche nei neuroni derivati da iPSC in seguito alla stimolazione luminosa conferma le connessioni sinaptiche con i neuroni corticali.
Utilizzare un microscopio confocale dotato di una lente a immersione in acqua 60x. Perfondere le celle a temperatura ambiente in una soluzione esterna, fatta gorgogliare costantemente con il 95% di ossigeno, il 5% di anidride carbonica. Utilizzare una soluzione interna per riempire la micropipetta di registrazione.
Per eseguire la stimolazione optogenetica, applicare un patch a una cellula tdTomato-positiva in modalità cella intera e impostare il morsetto di tensione a 70 millivolt negativi. Con la lampada al mercurio a campo intero e un filtro di eccitazione 480-over-40, stimola l'intero campo per 30 secondi. Registrare le correnti postsinaptiche, o PSC, di una cellula patchata indotta dalla fotostimolazione dei neuroni corticali presinaptici che esprimono ChR2.