Imaging in diretta degli assoni spinali dopo rizotomia
September 1st, 2011
Un In vivo Immagini di protocollo per monitor principale assoni sensoriali seguenti schiacciare spinali è descritto. Le procedure di utilizzo ad ampio campo di microscopia a fluorescenza e topi transgenici Thy1-YFP, e permettere l'imaging ripetuta di rigenerazione degli assoni più di 4 cm nel SNP e le interazioni degli assoni con l'interfaccia del sistema nervoso centrale.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare la rigenerazione della radice dorsale al fine di scoprire un mezzo per indurre una rigenerazione significativa dopo lesioni della radice spinale. Ciò si ottiene creando prima un'emilaminectomia spinale che espone la radice dorsale L cinque destra e consente la visualizzazione degli assoni positivi marcati YFP nel midollo spinale e nella radice dorsale. Successivamente, la radice dorsale L cinque viene schiacciata con cura per garantire un sanguinamento minimo.
Il sito di schiacciamento viene quindi ripreso dopo lo schiacciamento per verificare la posizione della radice dorsale lesa nella lesione. Nel corso di diversi punti temporali, il sito della lesione e la zona di ingresso della radice dorsale vengono visualizzati per determinare la capacità degli assoni danneggiati di rigenerarsi nel midollo spinale. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano che gli assoni rigeneranti sono rapidamente immobilizzati e rimangono fermi quando entrano nella zona di ingresso della radice dorsale o DREZ.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come l'imaging in un animale morto, è che possiamo visualizzare questo sistema in un animale vivente ripetutamente per un periodo di settimane o addirittura mesi. Per prima cosa, posizionare un termoforo termostatico sotto uno stereomicroscopio fluorescente e regolare l'uscita a 32,5 gradi Celsius su un termoforo, regolato a 32,5 gradi Celsius preriscaldare la soluzione sterile di ringer a 32,5 gradi Celsius per l'irrigazione del midollo spinale Durante l'intervento chirurgico, anestetizzare l'animale con un'iniezione intraperitoneale di un cocktail di xilazina e ketamina. Una dose iniziale dell'analgesico buprenorfina viene somministrata anche per via sottocutanea.
Un livello adeguato di anestesia si ottiene quando il riflesso palpabile è assente e l'animale non risponde a un pizzicamento del dito del piede. Una volta confermata l'anestesia, radere la parte superiore della schiena con un tagliacapelli per piccoli animali e spalmare una piccola goccia di lozione depilatoria sulla zona rasata con tamponi di cotone. Pochi minuti dopo, rimuovere la lozione applicata e l'eventuale pelo rimasto con acqua saponata.
Infine, utilizzando spugne di garza imbevute di etanolo al 70% per pulire completamente il campo chirurgico. Posizionare l'animale sul termoforo e disinfettare la pelle con tamponi imbevuti di etanolo al 70%. Tuttavia, a scopo dimostrativo dovrebbe essere applicato un telo chirurgico sterile.
Non viene mostrato in questo video. Sotto l'illuminazione a campo chiaro sullo stereomicroscopio, praticare un'incisione della linea mediana di due o tre centimetri nella pelle della schiena. Se necessario, utilizzare tamponi di cotone per fermare l'emorragia.
Rifletti la muscolatura spinale con una pinza fine e mascelle ossee. Per esporre le vertebre lombari sottostanti. Esporre i segmenti spinali da L tre a S uno mediante emilaminectomia sul lato destro utilizzando piccoli giurati r e quindi perfondere la cavità con una soluzione calda sterile per suoneria.
Posizionare l'animale su un cuscino di supporto in garza di cotone arrotolata. Per appiattire la colonna vertebrale. Utilizzare i ganci di retrazione per allargare l'area esposta.
A questo punto, circa 30 minuti dopo la prima iniezione di anestetico, è necessario iniettare un integratore per mantenere l'animale completamente anestetizzato. Passa all'eccitazione fluorescente per visualizzare il motivo per cui FP ha marcato gli assoni. Utilizzando la punta di un ago calibro 27 e mezzo, eseguire una piccola incisione nella dura madre sovrastante il perfuso della radice dorsale L cinque ripetutamente con una soluzione di ringer e pulire delicatamente con tamponi di cotone.
Identificare il sito da frantumare e acquisire immagini di tutta l'area esposta non danneggiata. Ciò aiuterà a identificare il sito della lesione nelle successive sessioni di imaging. Quindi inserire un lato di un paio di pinze sottili.
Chiudere debitamente la pinza delicatamente ma saldamente tenendo la parte mediale della radice L five per 10 secondi, quindi rilasciare delicatamente la pinza. Lavare ripetutamente con soluzione fisiologica e pulire delicatamente con tamponi di cotone. Ottenere più immagini dell'intera area esposta, compreso il sito di schiacciamento e il DREZ prima e subito dopo lo schiacciamento sia a basso che ad alto ingrandimento.
Dopo aver eseguito l'imaging in modo rigoroso, applicare un pezzo di sottile membrana a matrice sintetica seguita da dura artificiale sopra il midollo spinale esposto, in modo che si adattino esattamente alla finestra del midollo spinale esposto. Chiudere la muscolatura con cinque punti di sutura sterili e chiudere l'incisione della linea mediana con clip per ferite. Iniettare soluzioni di ringer per via sottocutanea e somministrare buprenorfina come analgesia postoperatoria tramite iniezione intramuscolare ogni 12 ore per due giorni.
Anestetizzare l'animale con xilazina e ketamina come descritto in precedenza e rimuovere le clip e i punti di sutura della ferita. Rimuovere la dura madre artificiale e i cerotti a membrana sintetica sottile e conservarli in una provetta sterile contenente una soluzione di ringer per un successivo riutilizzo. Quindi, rimuovere delicatamente il tessuto cicatriziale connettivo accumulato con la punta piegata di un ago calibro 26 e una pinza sottile perfondendo frequentemente con una soluzione calda di ringer.
Esporre nuovamente il campo operatorio, compreso il sito di schiacciamento e la zona di ingresso della radice dorsale, e riposizionare gli assoni marcati con YFP ripresi nelle sessioni precedenti per continuare l'imaging durante la rigenerazione. Qui quattro assoni superficiali marcati YFP indicati da frecce colorate sono mostrati immediatamente dopo lo schiacciamento. Tre giorni dopo lo schiacciamento, tutti e quattro gli assoni estendono un singolo neurite che cresce attraverso il sito di schiacciamento come evidenziato in due cinque giorni dopo lo schiacciamento.
I neuriti rimangono stabili e non c'è crescita aggiuntiva da questi o altri assoni prossimali. Al quarto giorno, i neuriti rigeneranti sono più sottili e più deboli degli assoni risparmiati. L'imaging ripetuto di questi assoni nelle loro punte ogni due o tre giorni per altre due settimane rivela che non sono cresciuti in avanti o si sono ritratti, ma sono rimasti immobili con il rigonfiamento delle punte e degli alberi di alcuni assoni.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esporre, schiacciare e osservare la radice L cinque per comprendere meglio i meccanismi che vietano o promuovono la rigenerazione assonale.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo di imaging in vivo per monitorare gli assoni sensoriali primari dopo la compressione della radice dorsale. Utilizzando la microscopia a fluorescenza a campo largo e topi transgenici thy1-YFP, il metodo permette l'imaging ripetuto della rigenerazione degli assoni per 4 cm nel SNC e delle loro interazioni con l'interfaccia del SNC.
Componenti chiave dello studio
Area di Scienza
- Neuroscienza
- Rigenerazione
- Tecniche di Imaging
Sfondo
- Comprendere la rigenerazione della radice dorsale è cruciale per sviluppare terapie per le lesioni delle radici spinali.
- Lo studio utilizza assoni positivi etichettati YFP per la visualizzazione.
- Ricerche precedenti hanno mostrato sfide nella rigenerazione degli assoni dopo lesioni spinali.
- Le tecniche di imaging sono essenziali per monitorare i processi di rigenerazione.
Obiettivo dello Studio
- Investigare i meccanismi di rigenerazione della radice dorsale.
- Esplorare metodi per indurre una significativa rigenerazione degli assoni dopo la lesione.
- Visualizzare il comportamento degli assoni in rigenerazione in tempo reale.
Metodi Utilizzati
- Emi-laminectomia spinale per esporre la radice dorsale L cinque destra.
- Cura della compressione della radice dorsale L cinque per minimizzare il sanguinamento.
- Imaging del sito di compressione per confermare la posizione della radice lesa.
- Imaging ripetuto nel tempo per valutare la rigenerazione degli assoni nel midollo spinale.
Risultati Principali
- Gli assoni in rigenerazione sono stati osservati essere rapidamente immobilizzati nella zona di ingresso della radice dorsale.
- L'imaging ha rivelato le dinamiche del comportamento degli assoni dopo la lesione.
- I risultati indicano sfide nel movimento degli assoni nel SNC.
- I dati supportano la necessità di ulteriori ricerche sui meccanismi di rigenerazione.
Conclusioni
- Il protocollo monitora efficacemente la rigenerazione degli assoni in vivo.
- I risultati contribuiscono alla comprensione del recupero delle lesioni del midollo spinale.
- Studi futuri potrebbero concentrarsi sul miglioramento delle tecniche di rigenerazione degli assoni.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Monitoring dorsal root axon regeneration in vivo provides critical insights into the biological barriers at the dorsal root entry zone, a key challenge in developing therapies for spinal root injuries. Real-time imaging enables mechanistic de-risking of regeneration hypotheses by capturing dynamic axon behavior over time, supporting target validation in preclinical models. This approach enhances predictive confidence in identifying molecular interventions that could promote CNS-PNS axon integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing axon immobilization at the DREZ, clarifying regeneration failure mechanisms.
- Operational Value: Supports biological de-risking through repeated longitudinal imaging of individual axons in living animals, reducing reliance on endpoint analyses.
- Predictive Value: Generates quantitative data on axon tip stability and growth arrest, informing target selection for pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a reproducible imaging platform using thy1-YFP mice and wide-field microscopy to monitor axon dynamics across multiple time points.
- Quantitative Output: Enables measurement of neurite extension, tip swelling, and immobilization, providing standardized readouts for compound screening.
- Scalability: Facilitates simultaneous tracking of multiple labeled axons per animal, increasing throughput for regeneration studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models sensory axon regeneration failure in spinal root injury, aligning with preclinical evaluation of neurorestorative therapies.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by capturing regeneration dynamics relevant to human DREZ biology.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic evidence to prioritize targets that overcome axonal immobilization at the CNS-PNS interface.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, offering dynamic validation of axon regeneration phenotypes before preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing real-time axon behavior at the DREZ, clarifying whether growth inhibition or guidance failure dominates regeneration failure.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible imaging of axon regeneration with quantifiable metrics such as neurite length and tip morphology over time.
- Analytics: Enables statistical comparison of regeneration conditions through repeated imaging sessions, supporting data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling the human DREZ barrier, informing biomarker strategies for axon growth competence.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging workflow for longitudinal neuroregeneration studies across multiple injury models and therapeutic candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity around axon regeneration failure at the DREZ.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through repeatable surgical and imaging procedures in living animals.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct visualization of axon regeneration outcomes, reducing late-stage biological risk in neuroregeneration programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of candidates based on demonstrated ability to promote axon growth past the DREZ barrier.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, anesthesia management, and in vivo wide-field fluorescence imaging.
- Dependent on access to thy1-YFP transgenic mouse lines and temperature-controlled imaging platforms to maintain physiological conditions.
- Necessitates standardized postoperative care and imaging intervals to minimize variability across longitudinal sessions.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different spinal regions or injury models beyond L5 dorsal root crush.
- Limited by the superficial positioning of labeled axons, which may restrict applicability to deeper CNS tracts without methodological modification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Preparation for Surgery
2:19
Laminectomy and Surgical Exposure of the L5 Dorsal Root
3:21
Rhizotomy/Dorsal Root Crush
4:10
Image Acquisition and Post-op Procedures
4:51
Repeated Imaging
5:32
Axonal Regeneration Following Dorsal Root Crush
6:16
Conclusion
