Rilevamento delle risposte fisiologiche dai neuroni sensoriali in Drosophila

Attacca una Drosophila melanogaster anestetizzata e geneticamente modificata su un lato a un vetrino coprioggetti.

Estendere le zampe anteriori e fissarle per esporre i segmenti tarsali.

Questi segmenti hanno neuroni gustativi che esprimono complessi indicatori di calcio che emettono fluorescenza in forma legata al calcio.

Disegna una barriera idrofobica attorno alla mosca per trattenere la soluzione.

Lasciare che la mosca si riprenda e sovrapporre una soluzione salina tamponata sui segmenti tarsali esposti per inumidirli.

Al microscopio confocale, osservare i segmenti tarsali e visualizzare i neuroni gustativi a varie profondità per ottenere una fluorescenza pre-stimolazione.

Aggiungere una soluzione di stimolazione contenente ligandi lipofili sul segmento.

Questi ligandi si legano ai recettori dei neuroni gustativi, avviando le vie di segnalazione e innescando l'apertura dei canali del calcio.

Ciò consente agli ioni calcio del fluido extracellulare di entrare nel citoplasma e legarsi ai complessi indicatori di calcio, con conseguente emissione di fluorescenza.

Quando osservato di nuovo, un aumento della fluorescenza neuronale conferma la risposta fisiologica neuronale al ligando.

Dopo aver anestetizzato la mosca, attaccala a un vetrino coprioggetti da 0,17 millimetri, usando una piccolissima goccia di smalto trasparente. Attacca il lato della mosca allo scivolo usando l'intera caduta. Successivamente, al microscopio da dissezione, utilizzare un pennello bagnato per estendere una zampa anteriore della mosca. Quindi, utilizzando due strisce di nastro adesivo molto sottili, fissare il primo e il quinto segmento tarsale al vetrino coprioggetti.

Se i neuroni nella proboscide devono essere visualizzati, posizionare un'altra sottile striscia di nastro adesivo sul rostro della proboscide per esporre il labello. Ora, crea un muro corto attorno alla mosca usando una penna PAP. Lasciare che l'anestesia svanisca per mezz'ora prima di effettuare le misurazioni. Per questo protocollo, preparare le diluizioni necessarie della soluzione madre di legante da 1 milligrammo per millilitro utilizzando PBST.

Per iniziare la procedura, sovrapporre 10 microlitri di PBST sui segmenti tarsali fissati ed esposti. Questo inumidisce la gamba e impedisce che vada fuori fuoco. Successivamente, mettere a fuoco i segmenti utilizzando un sistema ottico in grado di ottenere un buon segnale di fluorescenza con una rapida risoluzione temporale, come un microscopio confocale a disco rotante con una fotocamera sCMOS. Raccogli tre pile Z di pre-stimolazione dei neuroni di interesse nel segmento tarsale.

In questo esempio, le immagini vengono acquisite con esposizioni di 200 millisecondi e un binning 2x2 su una sezione di 6 micron x 1/2 micron ogni due secondi. Assicurati di ottimizzare la potenza del laser per ridurre al minimo il fotobleaching, pur consentendo un elevato rapporto segnale/rumore. Qui, un laser a 491 nanometri e 100 milliwatt viene azionato al 30% di trasmissione.

Il segnale deve essere rilevabile prima della stimolazione, ma non avvicinarsi alla saturazione. Ora, pipettare 10 microlitri di soluzione di stimolazione sul segmento tarsale di interesse. Durante il pipettaggio, fare molta attenzione a non toccare la gamba o qualsiasi parte del corpo del moscerino, altrimenti i tarsi si sposteranno fuori posizione. Quindi, acquisire immediatamente le prime immagini post-stimolazione e continuare a raccogliere immagini sufficienti per documentare il massimo cambiamento nella fluorescenza.