Stimolazione optogenetica e registrazione elettrofisiologica di eventi sinaptici in fette di cervello di ratto

0 visualizzazioni3:18 min • July 8th, 2025

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Inizia con una fetta di cervello di ratto contenente la regione del neurone bersaglio collegata a un assone sensibile alla luce di una diversa regione del cervello.

Posizionare la fetta nella camera di registrazione sommersa e fissarla con un'ancora.

Al microscopio, individuare lo strato desiderato e identificare il neurone piramidale bersaglio.

Sollevare l'obiettivo del microscopio per creare un menisco con la superficie della fetta.

Immergere una micropipetta di vetro riempita con soluzione di registrazione intracellulare in questo menisco.

Toccare la cellula piramidale identificata con la punta della pipetta per creare una rientranza nella membrana.

Applicare l'aspirazione per formare un sigillo.

Aumentare l'aspirazione fino a quando la membrana non si rompe, stabilendo una configurazione a cella intera.

Utilizzando una sorgente luminosa montata, applicare impulsi luminosi alla fetta.

Questi impulsi luminosi innescano un potenziale d'azione nell'assone sensibile alla luce, rilasciando neurotrasmettitori nella fessura sinaptica.

Registra le risposte del neurone piramidale a questi rilasci per analizzare l'efficienza sinaptica.

Per l'identificazione della cellula bersaglio, posizionare la fetta nella camera di registrazione e immobilizzarla utilizzando un'ancora a fetta. A basso ingrandimento, utilizzando l'illuminazione a infrarossi, passare al livello LEC 5. Quindi, passare all'obiettivo ad immersione in acqua ad alto ingrandimento e identificare i neuroni piramidali.

Contrassegnare la posizione della cella sul monitor con del nastro adesivo. Successivamente, per formare un patch clamp a cellula intera, fabbricare una micropipetta in vetro borosilicato e riempirla con una soluzione di registrazione intracellulare. Posizionare la micropipetta piena nel portaelettrodo e applicare una pressione positiva soffiando con forza in un boccaglio collegato alla porta laterale del portaelettrodo.

Sollevare l'obiettivo del microscopio in modo che si formi un menisco e inserire l'elettrodo nel menisco fino a quando non può essere visto sul microscopio. Aprire la finestra di prova della tenuta e determinare se la resistenza della pipetta è compresa tra tre e cinque megaohm. Quindi, toccare la cellula identificata con la punta di una pipetta provocando una rientranza nella membrana cellulare.

Quindi, applicare una pressione negativa aspirando il boccaglio, aumentando la resistenza della pipetta. Continuare ad applicare gradualmente una pressione negativa fino alla rottura della membrana cellulare, con conseguente transitori di capacità dell'intera cella. Per accedere alla configurazione a pinza amperometrica, utilizzare un LED montato diretto nel percorso luminoso del microscopio con cubi filtranti e ottiche appropriate e applicare impulsi luminosi alla fetta tramite l'obiettivo 40x. Eroga treni di impulsi luminosi multipli a 5 Hertz, 10 Hertz e 20 Hertz per studiare le proprietà di rilascio presinaptico.

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Ultimo aggiornamento: 1 agosto 2026