JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:42 min • July 8th, 2025
Collocare un preparato neuromuscolare larvale di Drosophila vivo in una camera di registrazione contenente soluzione fisiologica priva di calcio.
I neuroni larvali esprimono un canale cationico sensibile alla luce.
Passa alla soluzione salina con aggiunta di calcio contenente un colorante fluorescente.
Il colorante emette una fluorescenza debole nello stato non internalizzato, ma fortemente quando viene internalizzato dai neuroni.
Illumina la larva con luce blu.
Questo attiva il canale, inducendo l'afflusso di cationi e la depolarizzazione dei neuroni, avviando un potenziale d'azione.
Il potenziale d'azione raggiunge il terminale sinaptico alla giunzione neuromuscolare, consentendo l'afflusso di calcio e l'esocitosi delle vescicole.
Successivamente, la membrana legata al colorante viene internalizzata durante il riciclo delle vescicole.
Lavare con soluzione fisiologica priva di calcio per fermare il riciclo delle vescicole e rimuovere qualsiasi colorante non internalizzato.
Visualizza il segnale di fluorescenza.
Quindi, introdurre soluzione salina senza coloranti con aggiunta di calcio e illuminare di nuovo.
Questo induce un altro potenziale d'azione, l'afflusso di calcio e l'esocitosi delle vescicole contenenti colorante.
Visualizza nuovamente il segnale.
Il rilascio di colorante dovuto all'esocitosi delle vescicole riduce la fluorescenza rispetto allo stato durante l'internalizzazione delle vescicole.
Per la stimolazione con canalrodopsina, collegare un LED blu a uno stimolatore programmabile utilizzando un cavo coassiale e posizionare il LED nella porta della fotocamera. Focalizzare il fascio di luce LED blu sulla preparazione con colorante FM utilizzando la funzione Zoom del microscopio.
Il passaggio più critico a questo punto della procedura è assicurarsi che le impostazioni dei LED siano mantenute costanti e che si illumini la stessa parte di ciascun animale per tutte le condizioni confrontate per garantire una forza di stimolazione costante.
Avvia la stimolazione luminosa e segui il timer per la durata predeterminata del periodo di stimolazione optogenetica. Quando il timer si ferma, rimuovere rapidamente la soluzione colorante FM e sostituirla con soluzione fisiologica priva di calcio per arrestare il ciclo SV. Per lo scarico del colorante FM, avviare la stimolazione luminosa e seguire con il timer per la durata predeterminata del periodo di stimolazione optogenetica. Al termine del periodo del timer, rimuovere rapidamente la soluzione colorante FM e sostituirla con soluzione fisiologica priva di calcio per interrompere il ciclo SV.