Registrazioni perforate Patch-Clamp dei corpi cellulari dei neuroni sensoriali dell'orecchio interno

Posizionare una coltura di corpi cellulari di neuroni sensoriali dell'orecchio interno in una camera di registrazione.

Riempire frontalmente una pipetta patch-clamp con una soluzione interna.

Riempire con la stessa soluzione contenente un antibiotico perforante la membrana, permettendogli di raggiungere gradualmente la punta.

Riempire due terzi della pipetta con la soluzione antibiotica, inserirla in un supporto contenente un elettrodo di registrazione e abbassarla nella camera.

Visualizza al microscopio per avvicinarti a un neurone.

Quando la punta della pipetta entra in contatto con il neurone, la superficie neuronale forma una fossetta e la resistenza aumenta.

Applicare una pressione negativa per formare una tenuta ermetica tra la pipetta e la membrana.

Mantenere il potenziale di tenuta vicino al potenziale di membrana a riposo.

L'antibiotico perfora la membrana, consentendo il movimento degli ioni tra la cellula e l'elettrodo per stabilire un ambiente ionico stabile.

Applicare gradini di tensione ai canali ionici voltaggio-dipendenti aperti, consentendo l'afflusso di ioni e generando correnti proporzionali alla funzione del canale ionico, che vengono registrate dall'elettrodo.

Immergere la punta della pipetta nella soluzione pulita della piastra di coltura, per riempirla con una soluzione pulita che non contenga amfotericina. Riempire il retro della pipetta con la soluzione interna contenente amfotericina. Immergere nuovamente la punta della pipetta nella soluzione pulita della capsula di coltura mentre l'amfotericina entra lentamente nella punta dal retro della pipetta. Quindi, terminare il riempimento della pipetta con la soluzione di amfotericina fino a 2/3 della pipetta.

Abbassare la pipetta nel bagno della camera di registrazione e posizionare la punta della pipetta al centro del campo visivo. Assicurarsi che la punta sia priva di bolle d'aria o altri detriti. Posizionare la pipetta vicino alla membrana e farla atterrare saldamente al centro della cellula. Applicare una pressione negativa o un'aspirazione utilizzando una siringa o una pipetta per bocca.

Attivare il potenziale di mantenimento di meno 60 millivolt. La resistenza della tenuta dovrebbe aumentare fino a superare un gigaohm. Una volta formata una guarnizione gigaohm, rilasciare la pressione negativa. L'amfotericina inizia a funzionare. La resistenza di ingresso diminuisce lentamente e la corrente che scorre in risposta al gradino di tensione di 5 millivolt aumenta progressivamente man mano che l'amfotericina entra nella membrana.