JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:11 min. • July 8th, 2025
Prendi i gangli della radice dorsale di ratto immobilizzati, o DRG, in una camera di registrazione perfusa con aCSF.
DRG contiene neuroni sensoriali circondati da cellule gliali satelliti.
Applicare una pressione positiva a una pipetta di cerotto riempita con soluzione intracellulare e collegata a un amplificatore, quindi farla avanzare verso il neurone bersaglio.
La pressione positiva aiuta ad attraversare lo strato di cellule gliali satelliti circostanti e a contattare il neurone, formando una rientranza sulla sua membrana.
Applicare una pressione negativa per formare una tenuta ermetica con la membrana.
Quindi, applicare impulsi di pressione negativa per stabilire la configurazione dell'intera cella. Calibrare i parametri dell'amplificatore per misurazioni accurate del segnale.
Per determinare l'eccitabilità del neurone, applicare brevi correnti incrementali nel neurone, aprendo i canali ionici voltaggio-dipendenti e innescando un potenziale d'azione.
Misura la reobase, la corrente minima necessaria per innescare un potenziale d'azione.
Inoltre, applicare una corrente di rampa per misurare il potenziale minimo di membrana al quale si verifica il potenziale d'azione.
In questa procedura, posizionare la soluzione dell'elettrodo sul ghiaccio per evitare la degradazione. Quindi, riempire la pipetta patch di vetro con una soluzione intracellulare filtrata. Quindi, posizionare la pipetta nel portapipetta dello stadio principale.
Applicare una leggera pressione positiva sulla pipetta attraverso una siringa da 5 millilitri spostando lo stantuffo di circa 1 millilitro prima di immergere la pipetta nella soluzione del bagno. Successivamente, scegliere la modalità V-clamp sull'amplificatore e aprire l'interfaccia di test della membrana nel software.
Al microscopio, avvicinare la pipetta al neurone bersaglio. Successivamente, applicare una pressione positiva dalla pipetta per attraversare lo strato di cellule gliali satelliti fino a quando non si osserva un improvviso allargamento dello spazio tra il neurone e lo strato circostante di cellule gliali satelliti. Quindi, continua a muovere la pipetta verso il neurone fino a quando non si osserva una fossetta sul neurone.
Nella nostra preparazione, i neuroni sono circondati da cellule gliali satelliti. Pertanto, per penetrare gli strati delle cellule gliali e raggiungere i singoli neuroni, la pipetta di registrazione viene mantenuta ad un'elevata pressione positiva.
Successivamente, ridurre la pressione positiva. Ottieni una tenuta gigaohm con un'aspirazione delicata.
Per ottenere la configurazione di registrazione dell'intera cellula, penetrare la membrana cellulare del neurone tramite un'aspirazione breve ma forte.
In alternativa, utilizzare la funzione zap sull'amplificatore mentre è applicata l'aspirazione.
Una volta stabilita la modalità a cella intera, compensare la capacità a cella intera e la resistenza in serie ruotando le manopole di compensazione della capacità e della resistenza sull'amplificatore. Quindi, chiudere la finestra di test della membrana. Scegli la modalità normale I-clamp ruotando la manopola della modalità sull'amplificatore.
Successivamente, fai clic su Apri protocollo nel software. Selezionare e caricare il protocollo per la misurazione della reobase, quindi fare clic su Registra per avviare la registrazione. Per esaminare l'eccitabilità neuronale, misurare la resistenza di ingresso e la reobase iniettando una serie graduata di correnti depolarizzanti a passi di 100 picoampere.