Valutazione delle sinapsi a nastro in regioni di frequenza specifiche della coclea di topo

Iniziare con tubi contenenti curve cocleari di topo pretrattate con un agente permeabilizzante e un agente bloccante che impediscono interazioni non specifiche.

Ogni giro rileva diverse frequenze sonore e contiene cellule ciliate che convertono il suono in segnali elettrici. Questi segnali vengono trasmessi tramite neurotrasmettitori nelle sinapsi a nastro al nervo uditivo.

Rimuovere la soluzione e aggiungere gli anticorpi primari che interagiscono con le proteine nei capelli e nelle cellule nervose nelle sinapsi a nastro, quindi lavare.

Incubare con anticorpi secondari marcati con fluorofori rossi e verdi, che si legano ai loro anticorpi primari.

Lavare per rimuovere gli anticorpi secondari non legati.

Posizionare il campione su un vetrino con un mezzo di montaggio contenente colorante nucleare per colorare i nuclei di blu.

Montare il vetrino coprioggetti. Asciugalo, quindi usa un microscopio confocale per visualizzare ogni segmento a varie profondità.

Le sinapsi a nastro appaiono come punti rossi e verdi posizionati ravvicinati.

Conta questi punti funzionali in ogni turno per correlare la loro risposta alla frequenza del suono.

Dopo la dissezione, posizionare ogni giro cocleare in singole provette da centrifuga da 2,5 millilitri. Bloccare qualsiasi legame aspecifico con siero di capra al 10% in PBS in Triton X-100 allo 0,1% per 1 ora a temperatura ambiente su un rotatore.

Al termine dell'incubazione, utilizzare un puntale per pipetta da 200 microlitri per rimuovere la soluzione al microscopio da dissezione. Incubare i campioni con gli anticorpi primari di interesse diluiti in siero di capra al 5% in PBS e Triton X-100 allo 0,1% per una notte a 4 gradi Celsius su un rotatore.

La mattina successiva, sciacquare i campioni di tessuto tre volte per 5 minuti con PBS molare freddo da 0,1 per lavaggio per rimuovere eventuali residui di anticorpi primari. Quindi, etichettare i campioni con gli anticorpi secondari appropriati diluiti in siero di capra al 5% in PBS e Triton X-100 allo 0,1% per due o tre ore a temperatura ambiente sul rotatore, al riparo dalla luce.

Al termine dell'incubazione, lavare i campioni tre volte con PBS 0,1 molare come dimostrato e trasferire i campioni in singole piastre da 35 millimetri contenenti PBS molare 0,1. Posizionare una goccia di mezzo di montaggio integrato con DAPI sul vetrino e trasferire i campioni dal PBS al supporto di montaggio. Posizionare un bordo di un vetrino coprioggetti su ogni vetrino e rilasciarlo per far cadere delicatamente i vetrini. Quindi, asciugare i vetrini in una scatola per vetrini a 4 gradi Celsius durante la notte.

Per l'imaging dei campioni, utilizzare un microscopio confocale con i laser appropriati e una lente a immersione in olio ad alta risoluzione 63x. Per acquisire z-stack confocali da 8 micrometri da ogni giro della coclea. Per la conta dei punti sinaptici, impostare le pile z con una dimensione del passo di 0,3 micrometri per coprire l'intera lunghezza delle cellule ciliate interne, assicurandosi che tutti i punti sinaptici possano essere ripresi, e unire le immagini contenenti punti in una pila per ottenere la proiezione dell'asse z.

Importare le immagini unite in un programma software di elaborazione delle immagini appropriato. Dividi i conteggi totali sinaptici in ogni z-stack a specifiche regioni di frequenza per il numero di cellule ciliate interne DAPI-positive per calcolare il numero di punti sinaptici per ciascuna cellula. In ogni specifica regione di frequenza, calcolare la media di tutti i punti sinaptici in 3 immagini di diversi campi microscopici contenenti da 9 a 11 cellule ciliate interne.

Per visualizzare meglio l'architettura del citoscheletro e la localizzazione sinaptica, utilizzare lo strumento pennello per valutare visivamente la struttura sinaptica e la distribuzione delle singole cellule ciliate interne. Per ispezionare la giustapposizione di nastri presinaptici e patch di recettori postsinaptici, utilizzare lo strumento di selezione rettangolare per estrarre lo spazio voxel attorno ai nastri e utilizzare il taglio dell'immagine per isolare i singoli nastri. Quindi, fare clic su Immagine e Dimensioni immagine per acquisire una serie di miniature di queste proiezioni in miniatura che possono essere utilizzate per identificare le sinapsi accoppiate rispetto ai nastri orfani.