JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 1:58 min. • July 8th, 2025
Prendi una coltura cellulare contenente cellule tumorali neuronali attaccate a un vetrino coprioggetti e mantienila in condizioni di freddo.
Rimuovere il terreno di coltura e lavare ripetutamente le cellule con tampone fosfato freddo per eliminare il terreno residuo.
Aggiungere un tampone di lisi contenente una bassa concentrazione di detergenti non ionici e inibitori della proteasi.
Il detergente non ionico distrugge la membrana cellulare per avviare la lisi.
Nel frattempo, gli inibitori della proteasi bloccano gli enzimi proteolitici cellulari, proteggendo le proteine dalla degradazione enzimatica.
Quindi, utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere le cellule parzialmente lisate dal vetrino coprioggetti.
Trasferire il contenuto in una provetta contenente il tampone di lisi.
In condizioni di freddo, utilizzare un omogeneizzatore per lisare meccanicamente le cellule, garantendo la completa lisi cellulare e il rilascio delle proteine.
Centrifugare il lisato cellulare.
Raccogliere il surnatante in un tubo nuovo.
Le proteine estratte dalle cellule tumorali neuronali sono ora pronte per ulteriori analisi.
Per la convalida dell'espressione proteica, 48 ore dopo la trasfezione, posizionare i piatti di coltura sul ghiaccio e lavare le cellule due volte con PBS. Trattare le cellule in ogni piatto con 200-400 microlitri di tampone di lisi e utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere le cellule dai vetrini.
Trasferire le cellule staccate da ciascuna piastra in singole provette da microcentrifuga e dissociare ulteriormente le cellule con un omogeneizzatore sotto ghiaccio. Dopo un minuto, pellettare i pezzi di cella omogeneizzati mediante centrifugazione.