Isolamento di proteine di superficie cellulare e intracellulari da una coltura di astrociti

Prendi una coltura di astrociti e rimuovi il terreno. Aggiungere un tampone fisiologico e incubare su ghiaccio, inibendo l'endocitosi delle proteine della superficie cellulare.

Incubare con un reagente di biotinilazione che lega le proteine della superficie cellulare.

Quindi, incubare con un tampone di estinzione per inattivare qualsiasi reagente non reagito.

Aggiungere un tampone fisiologico freddo e staccare meccanicamente le cellule. Trasferire le cellule, quindi centrifugare e scartare il surnatante.

Incubare con un tampone di lisi per lisare le cellule, rilasciando proteine intracellulari biotinilate della superficie cellulare e non biotinilate.

Centrifugare, raccogliere il surnatante e separare una frazione con il contenuto proteico totale.

Incubare la frazione rimanente sotto agitazione con perle rivestite di streptavidina che legano le proteine biotinilate.

Ruotare verso il basso le perle legate alle proteine della superficie cellulare e separare il surnatante contenente le proteine intracellulari.

Lavare le perle sotto agitazione per rimuovere le proteine non specificamente legate, quindi centrifugare e scartare il surnatante, isolando le proteine della superficie cellulare.

Le frazioni contenenti proteine totali, intracellulari e della superficie cellulare sono pronte per l'analisi.

Per iniziare questa procedura, rimuovere le colture di astrociti dall'incubatrice e scartare il terreno mediante aspirazione. Lavare le cellule tre volte con 4 millilitri di CM-PBS raffreddato e posizionare i piatti su ghiaccio tritato.

Rimuovere il CM-PBS per aspirazione, quindi pipettare due millilitri di tampone di biotina in ciascun pozzetto. Inclinare delicatamente i piatti avanti e indietro alcune volte, per garantire una copertura completa prima di mettere le colture sul ghiaccio per 30 minuti.

Successivamente, rimuovere il tampone di biotina, sostituirlo con quattro millilitri di tampone di estinzione e mantenere le colture in ghiaccio per 10 minuti. Quindi, aspirare e sostituire con la stessa quantità di tampone di tempra prima di lasciare le colture in ghiaccio per 10 minuti.

Quindi, scartare il tampone di tempra e lavare le celle tre volte con 4 millilitri di CM-PBS raffreddato. Successivamente, raschiare le cellule in un millilitro di CM-PBS raffreddato e trasferire la sospensione in una provetta da microcentrifuga.

Successivamente, pellettare le celle mediante centrifugazione a 100 g per tre minuti in una microcentrifuga refrigerata impostata a 4 gradi Celsius. Successivamente, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone di lisi.

Quindi, lasciare i campioni sul ghiaccio per 30 minuti, vorticando ogni cinque minuti. Successivamente, centrifugare il lisato a 14.000 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius per pellettare qualsiasi detergente e materiale solubile. Quindi, trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga. Risparmia 50 microlitri di lisato e aggiungi 25 microlitri di tampone di caricamento 3x.

Successivamente, denaturarlo riscaldandolo a 95 gradi Celsius in un bagno asciutto. Questa è la frazione di input contenente sia proteine biotinilate della superficie cellulare, sia proteine citosoliche non biotinilate. Utilizzando un puntale di pipetta tagliato, trasferire 75 microlitri di perle di agarosio streptavidina nel lisato e incubarlo a 4 gradi Celsius per tre ore su uno shaker.

Successivamente, pellettare le perle di agarosio streptavidina mediante centrifugazione a 1.500 g per 30 secondi a quattro gradi Celsius. Risparmia 50 microlitri di surnatante e aggiungi 25 microlitri di tampone di caricamento 3x. Quindi, denaturarlo a 95 gradi Celsius a bagnomaria o in un blocco riscaldante. Questa rappresenta la frazione intracellulare ed è composta principalmente da proteine citosoliche non biotinilate.

Successivamente, risospendere le perle pellettate in un millilitro di tampone di lavaggio e farle oscillare per tre minuti a 4 gradi Celsius. Pellettare le perline e scartare il surnatante. Ripetere questo processo altre quattro volte per ridurre al minimo il legame aspecifico delle proteine citosoliche non biotinilate.

Aggiungere 50 microlitri di tampone di carico diluito a 1x utilizzando il tampone di lisi. Rilascia biotina e streptavidina dalle perle denaturandole a 95 gradi Celsius. Questa frazione deve contenere solo proteine biotinilate della superficie cellulare.