Isolamento di proteine di superficie cellulare e intracellulari da una coltura di astrociti

Prendi una coltura di astrociti e rimuovi il terreno. Aggiungere un tampone fisiologico e incubare su ghiaccio, inibendo l'endocitosi delle proteine della superficie cellulare.

Incubare con un reagente di biotinilazione che lega le proteine della superficie cellulare.

Quindi, incubare con un tampone di estinzione per inattivare qualsiasi reagente non reagito.

Aggiungere un tampone fisiologico freddo e staccare meccanicamente le cellule. Trasferire le cellule, quindi centrifugare e scartare il surnatante.

Incubare con un tampone di lisi per lisare le cellule, rilasciando proteine intracellulari biotinilate della superficie cellulare e non biotinilate.

Centrifugare, raccogliere il surnatante e separare una frazione con il contenuto proteico totale.

Incubare la frazione rimanente sotto agitazione con perle rivestite di streptavidina che legano le proteine biotinilate.

Ruotare verso il basso le perle legate alle proteine della superficie cellulare e separare il surnatante contenente le proteine intracellulari.

Lavare le perle sotto agitazione per rimuovere le proteine non specificamente legate, quindi centrifugare e scartare il surnatante, isolando le proteine della superficie cellular