Valutazione dell'attività attrattiva o repulsiva delle proteine utilizzando i neuroni dell'ippocampo

Inizia con una parabola contenente una matrice di silicio che ha più piccoli canali collegati alle porte di ingresso e uscita.

Iniettare la proteina di prova con attività repulsiva attraverso l'ingresso per riempire i canali.

Incubare per consentire l'adesione delle proteine nell'area del canale, formando le zone proteiche di prova, quindi lavare.

Rimuovere la matrice, sovrapporre l'area rivestita con una proteina di controllo che possiede attività attrattiva e incubare.

Ciò facilita l'aderenza della proteina di controllo alle aree vuote tra le zone proteiche del test, creando zone proteiche di controllo con un motivo a strisce alternate, quindi lavaggio.

Aggiungere la laminina per ricoprire l'area a strisce, quindi lavare.

Seminare l'area rivestita con una sospensione unicellulare di neuroni ippocampali e incubare.

Nella zona delle proteine di prova, i neuroni interagiscono con le proteine, innescando segnali che causano la repulsione dei neuroni, inibendo il loro attaccamento.

Al contrario, le interazioni neurone-proteina nella zona proteica di controllo promuovono l'attaccamento neuronale, supportandone la crescita e l'estensione degli assoni.

Preparare le proteine ricombinanti marcate in fluorescenza in PBS. Prepara 25 microlitri per ogni piatto a strisce. Lasciare incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, per ogni piatto, caricare una siringa calibro 22 con 25 microlitri di proteina diluita e iniettarla attraverso il piccolo foro sul lato della matrice.

Evita l'iniezione di bolle d'aria nelle matrici in quanto disturberebbero il legame delle proteine sulla malattia.

Ora, incubare le piastre per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari. Dopo l'incubazione, depositare 300 microlitri di PBS nella fessura superiore di ciascuna matrice. Quindi, aspirare il PBS da un piccolo foro situato sul lato di ciascuna matrice per rimuovere tutte le proteine ricombinanti non attaccate. Non aspirare completamente il PBS perché le proteine si seccheranno.

Eseguire questo risciacquo PBS per un totale di tre volte. Quindi, rimuovi con cura la matrice da ogni piatto. Quindi, aggiungi immediatamente circa 100 microlitri di proteine di controllo su tutta l'area a strisce, creando un rivestimento alternato su ogni piatto.

Quindi, incubare i piatti per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Nel frattempo, con ghiaccio, scongelare la laminina in PBS a 20 microgrammi per millilitro. Dopo 30 minuti, lavare i piatti tre volte con PBS. Quindi, ricoprire ogni piatto con circa 100 microlitri di laminina fredda e rimettere i piatti nell'incubatrice per un'altra ora.

Un'ora dopo, usa il PBS per lavare i piatti tre volte di nuovo. Dopo il terzo lavaggio, aggiungere circa 150 microlitri di terreno di coltura a ciascun piatto. Quindi, incubare le piastre in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius fino al momento in cui sono necessarie. Conta le cellule usando un emocitometro e riproduci 10.000 neuroni in 150 microlitri di terreno di coltura su ogni piastra a strisce preparata. Depositare con cura la sospensione per coprire l'intera regione della striscia.