Quantificazione dell'actina puntina filamentosa nei neuroni corticali di ratto

Prendete i neuroni corticali primari di ratto in un piatto rivestito di polimero con fondo di vetro.

Fissare i neuroni con paraformaldeide per preservare le strutture cellulari.

Lavare via la paraformaldeide in eccesso.

Aggiungere un detergente non ionico per permeabilizzare le cellule.

Trattare le cellule con una colorazione fluorescente verde mirata alla proteina strutturale actina filamentosa, o F-actina.

Rimuovere la macchia in eccesso.

Applicare un agente bloccante per prevenire il legame non specifico degli anticorpi.

Incubare con anticorpi primari che hanno come bersaglio le proteine dendritiche.

Rimuovere gli anticorpi non legati.

Aggiungere anticorpi secondari rossi coniugati con fluorofori per legarsi agli anticorpi primari. Lavare via gli anticorpi in eccesso.

Applicare un colorante fluorescente per macchiare i nuclei. Rimuovere il colorante non legato.

Aggiungere un reagente anti-dissolvenza per prevenire il fotosbiancamento con fluoroforo.

Utilizzando la microscopia a fluorescenza, acquisisci immagini dei neuroni.

Identificare una regione ricca di F-actina all'interno del dendrite marcato.

Utilizzando il software, conta i punti o le macchie di F-actina e traccia manualmente la lunghezza del dendrite per calcolare la densità di F-actina.

Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente, seguito da due lavaggi PBS. Successivamente, permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,1% in PBS per 5 minuti ed etichettarle con un colorante specifico per F-actina a temperatura ambiente. Dopo 20 minuti, sciacquare le cellule due volte con PBS e bloccare qualsiasi colorazione aspecifica della superficie cellulare con il 10% di siero di capra normale.

Al termine dell'incubazione, etichettare le cellule per una notte a 4 gradi Celsius con l'anticorpo policlonale anti-MAP2 di pollo. La mattina successiva, sciacquare le cellule due volte con PBS ed etichettarle con l'anticorpo secondario appropriato.

Dopo due ore a temperatura ambiente, sciacquare nuovamente le celle con PBS ed etichettarle con 10 microlitri di Hoechst per tre minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare le cellule due volte con PBS e conservarle con 100 microlitri di reagente anti-sbiadimento.

Entro tre giorni dalla colorazione, accendere il microscopio a fluorescenza e selezionare l'obiettivo 20x. Successivamente, nel software del microscopio, impostare la dimensione dell'immagine in pixel su 1.600 per 1.200 e la risoluzione dell'immagine di 0,17 micron per pixel su zoom 1x. Trasferire il piatto di cellule sul tavolino del microscopio e acquisire immagini dei neuroni MAP2 F-actina co-marcati sotto i canali fluorescenti verde e rosso.

Quando tutte le immagini sono state ottenute, scegliere cinque immagini di singoli neuroni nei canali verde, rosso e blu con pergole dendritiche chiaramente definite e utilizzare l'immunofluorescenza continua MAP2 per identificare le strutture ricche di F-actina nei segmenti dendritici del secondo ordine. Ruota orizzontalmente l'area selezionata delle immagini e copia e incolla l'area come nuova immagine.

Quindi, sottrarre la fluorescenza dello sfondo dell'immagine e utilizzare il software per contare il numero di punti F-actina verde brillante. Utilizzare osservatori indipendenti addestrati per misurare la lunghezza dei segmenti dendritici selezionati, quindi esportare i numeri dei punti e i dati sulla lunghezza dei segmenti dendritici in un file di foglio di calcolo.

Assicurarsi che gli osservatori includano punti F-actina positivi con un'intensità di fluorescenza di picco di almeno il 50% superiore all'intensità media di colorazione nell'asta dendritica in ciascun segmento selezionato.

Infine, calcola la densità secondo la formula, esprimendo i dati come numero di F-actina puncta per 10 micron di dendrite.