JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:38 min. • July 8th, 2025
Prendi un estratto di tessuto cerebrale di topo contenente proteine non amiloidi e fibrille amiloidi, un aggregato proteico insolubile.
Aggiungere il saccarosio solido e mescolare, aumentando la densità della soluzione.
Trasferirlo e centrifugarlo per separare le proteine più dense dai detriti.
Scartare il surnatante, risospendere il pellet in un tampone a concentrazione di saccarosio più elevata, mescolare e centrifugare.
Raccogli lo strato superiore contenente alcune fibrille amiloidi in un tubo nuovo, aggiungi un tampone di lavaggio e mescola.
Ora, scartare lo strato intermedio e trasferire il pellet arricchito con fibrille amiloidi nel tubo contenente la frazione dello strato superiore per il massimo isolamento.
Centrifugare le frazioni combinate e scartare il surnatante. Aggiungere un tampone di digestione e incubare per degradare esclusivamente le proteine non amiloidi.
Centrifugare e rimuovere il surnatante. Lavare il pellet per rimuovere le proteine digerite residue.
Risospendere il pellet in un tampone di solubilizzazione a base di saccarosio contenente un detergente che solubilizza le restanti proteine non amiloidi.
Centrifugare, rimuovere il surnatante e risospendere le fibrille amiloidi isolate.
Inizia posizionando una regione di tessuto cerebrale appena sezionata o congelata in una provetta da due millilitri contenente da sei a otto perle di ceramica e un tampone di omogeneizzazione ghiacciato appena preparato. Quindi, macinare il tessuto utilizzando un omogeneizzatore a sfere a 4.000 giri/min, con due cicli di 30 secondi a impulsi on e off. Ora, aggiungere nove millilitri di tampone di omogeneizzazione ghiacciato al millilitro di omogeneizzato di tessuto cerebrale in una provetta da 15 millilitri e sigillare con strisce di pellicola di cera da laboratorio.
Per garantire una solubilizzazione robusta, mantenere la provetta in rotazione per una notte a 4 gradi Celsius. Il giorno seguente, aggiungere saccarosio solido alla sospensione di estratto tissutale fino a una concentrazione finale di 1,2 moli. Mescolare bene e centrifugare a 250.000 volte g per 45 minuti a 4 gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in due millilitri di tampone di omogeneizzazione contenente 1,9 molari di saccarosio triturando e centrifugare a 125.000 volte g per 45 minuti a 4 gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, trasferire lo strato solido bianco superiore in una provetta nuova e solubilizzare in 1 millilitro di tampone di lavaggio ghiacciato pipettando su e giù più volte. Poiché il pellet è anche arricchito con fibrille amiloidi, scartare lo strato intermedio acquoso e combinare il pellet con lo strato superiore per una resa maggiore. Centrifugare le frazioni combinate a 8.000 volte g per 20 minuti a 4 gradi Celsius.
Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in 1 millilitro di tampone di digestione ghiacciato e incubare a temperatura ambiente per tre ore su un vortice. Centrifugare nuovamente il campione, quindi lavare due volte il pellet in 1 millilitro di tampone Tris ghiacciato e centrifugare nuovamente. Dopo il secondo lavaggio, risospendere il pellet in 1 millilitro di tampone di solubilizzazione pipettandolo su e giù e centrifugare rapidamente la provetta a 200.000 volte g per 60 minuti a 4 gradi Celsius.
Conservare il pellet, quindi ridurre la concentrazione di saccarosio da 1,3 a 1 molare aggiungendo 50 millimolari di tampone Tris al surnatante. Centrifugare nuovamente il surnatante, quindi sciogliere entrambi i pellet in 100 microlitri di tampone Tris contenente lo 0,5% di SDS. Per la purificazione dell'amiloide, solubilizzare i pellet ricchi di amiloide utilizzando onde ultrasoniche in un dispositivo di sonicazione a bagno per 20 cicli. Quindi, centrifugare immediatamente il materiale a 20.000 volte g per 30 minuti a 4 gradi Celsius.
Risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone SDS Tris allo 0,5% e ripetere il lavaggio altre quattro volte. Dopo l'ultima fase di centrifugazione, lavare il pellet in 200 microlitri di acqua ultrapura e centrifugare a 20.000 volte g per 30 minuti a 4 gradi Celsius per rimuovere eventuali residui di detersivo. Sciogliere il pellet finale contenente fibrille amiloidi purificate in 100 microlitri di acqua ultrapura.