Valutazione della vitalità neuronale in una coltura di neuroni cerebellari mediante doppia colorazione

Inizia con una piastra di coltura trattata con un agente anti-mitotico che inibisce la crescita delle cellule gliali, lasciando principalmente i neuroni dei granuli cerebellari e un piccolo numero di cellule gliali.

Rimuovere il terreno e aggiungere lentamente soluzione salina tamponata con fosfato freddo o PBS per mantenere la vitalità cellulare.

Sostituire il tampone con una miscela colorante a freddo e incubare.

Questa miscela contiene fluoresceina diacetato o FDA, un composto non fluorescente, e ioduro di propidio o PI, un colorante fluorescente impermeabile alla membrana.

La FDA si diffonde nelle cellule, dove l'esterasi funzionale nelle cellule vive la converte in un composto fluorescente verde.

Il PI entra nelle cellule morte attraverso le membrane danneggiate, si lega al DNA ed emette fluorescenza rossa.

Rimuovere la soluzione colorante e aggiungere PBS freddo per evitare che le celle si secchino.

Ottenere immagini fluorescenti per le colorazioni FDA e PI e un'immagine a contrasto di fase. Unisci le immagini FDA e PI.

Quindi confronta questa immagine a fluorescenza con l'immagine a contrasto di fase, che aiuta a escludere le grandi cellule gliali.

La

fluorescenza rossa indica la morte neuronale, mentre la fluorescenza verde indica la vitalità neuronale.

Iniziare la colorazione mescolando fluoresceina diacetato a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e ioduro di propidio a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro in 10 millilitri di PBS. Mescolare la soluzione FDA PI a vortice e metterla sul ghiaccio. Metti la piastra di coltura sul ghiaccio.

Aspirare con cura il terreno di coltura senza toccare le cellule con il puntale della pipetta. Quindi, aggiungi lentamente il PBS freddo. Aspirare il PBS, quindi aggiungere la soluzione di lavoro FDA PI fredda o FDA PI Hoechst. Metti il piatto sul ghiaccio per cinque minuti. Successivamente, dopo aver aspirato la soluzione di lavoro FDA PI o FDA PI Hoechst, aggiungere PBS freddo a ciascun pozzetto.

Assicurarsi che il microscopio a fluorescenza sia impostato correttamente. Rileva le emissioni di fluorescenza per FDA PI e Hoechst rispettivamente a 520, 620 e 460 nanometri, utilizzando un tempo di esposizione compreso tra 100 e 300 millisecondi e un guadagno analogico di 2,8X. Dopo aver raccolto le immagini a fluorescenza, scattare un'immagine in condizioni di luce normale utilizzando la modalità Contrasto di fase.

Per la doppia colorazione PI FDA, sovrapporre le immagini delle cellule trascinando il livello positivo FDA sopra il livello PI positivo nel software di editing grafico. Regolate l'opacità del livello positivo per la FDA inserendo il 50% nel campo di opacità del pannello Livelli. Unisci due livelli aprendo il menu Livello e facendo clic sul pulsante Unisci visibile. Impostare il contrasto delle immagini sovrapposte inserendo 50 nel campo di contrasto in Immagine, Regolazioni, Luminosità/Contrasto. Verificare che non siano presenti celle doppie positive FDA e PI nelle immagini in sovrimpressione.

Per la tripla colorazione FDA PI Hoechst, sovrapporre le immagini delle cellule, trascinando nuovamente il livello positivo per la FDA sul livello positivo per la FDA, regolando l'opacità del livello positivo per la FDA e unendo le immagini come prima. Quindi, trascinare il livello positivo di Hoechst sul livello unito.

Regola l'opacità del livello positivo di Hoechst inserendo il 50% nel campo di opacità del pannello Livelli, e unisci i due livelli aprendo il menu Livello e facendo clic sul pulsante Unisci visibile. Distingui visivamente le cellule gliali grandi e irregolari dai neuroni granulari cerebellari confrontando le immagini scattate in modalità fluorescente con quelle scattate in modalità contrasto di fase.