Valutazione della vitalità neuronale in una coltura di neuroni cerebellari mediante doppia colorazione

Inizia con una piastra di coltura trattata con un agente anti-mitotico che inibisce la crescita delle cellule gliali, lasciando principalmente i neuroni dei granuli cerebellari e un piccolo numero di cellule gliali.

Rimuovere il terreno e aggiungere lentamente soluzione salina tamponata con fosfato freddo o PBS per mantenere la vitalità cellulare.

Sostituire il tampone con una miscela colorante a freddo e incubare.

Questa miscela contiene fluoresceina diacetato o FDA, un composto non fluorescente, e ioduro di propidio o PI, un colorante fluorescente impermeabile alla membrana.

La FDA si diffonde nelle cellule, dove l'esterasi funzionale nelle cellule vive la converte in un composto fluorescente verde.

Il PI entra nelle cellule morte attraverso le membrane danneggiate, si lega al DNA ed emette fluorescenza rossa.

Rimuovere la soluzione colorante e aggiungere PBS freddo per evitare che le celle si secchino.

Ottenere immagini fluorescenti per le colorazioni FDA e PI e un'immagine a contrasto di fase. Unisci le immagini FDA e PI.

Quindi confronta questa immagine a fluorescenza con l'immagine a contrasto di fase, che aiuta a escludere le grandi cellule gliali.

La

fluorescenza rossa indi