Visualizzazione dei neuroni del corpo a fungo nel cervello di Drosophila tramite immunocolorazione

Mettere i cervelli di Drosophila wild-type e mutanti in una soluzione contenente un fissativo e un detergente. Incubare con un leggero dondolio.

Il fissativo preserva la morfologia tissutale, mentre il detergente permeabilizza le membrane cellulari.

Lascia che il cervello si calmi, quindi rimuovi la soluzione.

Lavare i fazzoletti con un tampone.

Aggiungere una soluzione bloccante per prevenire il legame di anticorpi non specifici.

Rimuovere la soluzione e aggiungere anticorpi primari mirati a una proteina specifica che regola lo sviluppo assonale nel corpo dei funghi del cervello, o neuroni MB.

Incubare per promuovere il legame degli anticorpi.

Lavare con tampone per rimuovere gli anticorpi non legati.

Incubare con anticorpi secondari coniugati con fluorofori che hanno come bersaglio gli anticorpi primari.

Lavare di nuovo per rimuovere gli anticorpi non legati, quindi risospendere il cervello in un mezzo di montaggio.

Monta i cervelli su un vetrino a ponte e visualizzali al microscopio a fluorescenza.

Rispetto al wild-type, i cervelli mutanti mostrano un fenotipo difettoso, con proiezioni errate assonali e lobi MB mancanti.

Al microscopio, utilizzare una pipetta P200 per trasferire da 10 a 15 cervelli sezionati nello stesso genotipo in una provetta per microcentrifuga da 0,5 millilitri riempita con paraformaldeide al 4% diluita in PTN. Quindi, incubare il cervello per 20 minuti con un lento dondolio a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, lasciare che il cervello si depositi sul fondo del tubo, quindi rimuovere il fissativo.

Successivamente, eseguire due lavaggi rapidi con 500 microlitri di PTN per lavaggio. Scambia il PTN non appena il cervello si deposita nel tubo. Successivamente, eseguire tre lunghi lavaggi con PTN agitando delicatamente a temperatura ambiente.

Dopo questi lavaggi, il cervello può essere conservato durante la notte a 4 gradi Celsius in PTN. Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio con PTN, incubare il cervello in 0,5 millilitri di soluzione bloccante per almeno 30 minuti a temperatura ambiente e con una leggera agitazione. Dopo aver rimosso la soluzione bloccante, aggiungere gli anticorpi primari diluiti nella soluzione bloccante e incubare il cervello a 4 gradi Celsius per due giorni con una leggera agitazione.

Rimuovere l'anticorpo primario utilizzando il regime di lavaggio PTN a 5 lavaggi, quindi applicare gli anticorpi secondari. Lasciare che questi anticorpi incubino con i tessuti per tre ore a temperatura ambiente mentre sono protetti dalla luce con l'oscillazione.

Dopo aver incubato il cervello nella soluzione di anticorpi secondari, applicare il regime di lavaggio PTN, coprendo i campioni con un foglio dopo ogni lavaggio, e terminare rimuovendo quanto più tampone possibile. Quindi, aggiungere 75 microlitri di terreno di montaggio fluorescente anti-sbiadimento e far scorrere il cervello e il terreno dentro e fuori dalla punta della pipetta una sola volta. Il tubo può quindi essere avvolto in un foglio e conservato a 4 gradi Celsius per diversi giorni, ma idealmente procedere direttamente con il montaggio.

Per montare i cervelli, costruisci uno scivolo a ponte. Posizionare due vetrini coprioggetti di base a circa 1 centimetro di distanza l'uno dall'altro su un vetrino caricato positivamente. Assicurarsi che il vetrino caricato positivamente sia rivolto verso l'alto. Quindi, far aderire i vetrini coprioggetti al vetrino con lo smalto per unghie e lasciare asciugare completamente lo smalto prima di procedere.

Quindi, posizionare il vetrino sotto uno stereomicroscopio e pipettare il cervello e il terreno nello spazio tra i vetrini. Assicurati di regolare l'illuminazione per migliorare la visualizzazione del cervello.

Quindi, aspirare il supporto di montaggio extra dal vetrino facendo attenzione a evitare il cervello. Quindi, rimuovere il supporto di montaggio in eccesso rimanente. Ciò consentirà di posizionare il cervello in modo più preciso.

Ora, usando il forcipe, orienta i cervelli in uno schema a griglia con i lobi antennali rivolti verso l'alto. Quindi, posiziona un vetrino coprioggetti sul cervello e usa lo smalto per unghie per sigillare i bordi del vetrino coprioggetti superiore che sono attaccati ai vetrini coprioggetti di base. A questo punto, caricare la cavità centrale con il nuovo supporto di montaggio in senso gocciolato, consentendo di aspirare il supporto sotto il vetrino coprioggetti per azione capillare. Quando la cavità è riempita, sigillarla completamente con uno smalto trasparente.