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Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:28 min • July 8th, 2025
Prendi le larve di pesce zebra anestetizzate in un piatto foderato con gel di agarosio e assicurati che il cervello sia rivolto verso l'alto per l'iniezione.
Posiziona il piatto sotto un microscopio per visualizzare i ventricoli cerebrali, che sono cavità piene di liquido all'interno del cervello in via di sviluppo.
Prendi un ago per microiniezione contenente una soluzione di lipopolisaccaridi, o LPS, un componente batterico per innescare una risposta immunitaria.
Posiziona l'ago sopra il tettone cerebrale, una regione contenente neuroni e cellule immunitarie residenti, in particolare la microglia.
Pungere il cervello con l'ago e iniettare la soluzione di LPS nel ventricolo.
La microglia nel tessuto circostante si lega all'LPS attraverso i recettori toll-like.
Il legame innesca il rilascio di citochine pro-infiammatorie, che reclutano neutrofili nel sito, portando alla neuroinfiammazione.
I neutrofili generano esplosioni di specie reattive dell'ossigeno e rilasciano enzimi proteolitici, con conseguente morte neuronale.
Trasferire le larve indotte dalla neuroinfiammazione in un terreno di coltura per mantenerle per i saggi a valle.
Impostare il micromanipolatore in modo che la punta dell'ago dell'apparecchio per microiniezione si trovi nello stesso campo visivo delle larve ad alto ingrandimento. Sciogliere una soluzione di agarosio al 2% in acqua distillata doppia utilizzando un forno a microonde. Versare l'agarosio fuso in un piatto di plastica. Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per trasportare le larve anestetizzate al centro di un piatto di plastica rivestito di agarosio al 2%.
Orientare le larve montate con il lato del cervello rivolto verso l'alto per l'accesso all'ago. Regolare l'ingrandimento del microscopio in modo che la struttura ventricolare cerebrale del pesce zebra sia chiaramente visualizzata nel campo visivo. Posiziona con cautela l'ago sopra il tettone cerebrale. Pulisci l'area del cervello con etanolo al 70% e perfora lentamente la pelle del cervello del pesce zebra con la punta dell'ago usando il micromanipolatore.
Premere il pedale per espellere un nanolitro di 1X PBS o diverse concentrazioni di lipopolisaccaride. Trasferire le larve in un terreno E3 pulito subito dopo l'iniezione.