Colorazione in immunofluorescenza per la visualizzazione di cellule staminali neurali proliferate in sezioni cerebrali di topo

Prendiamo le sezioni fisse del cervello del topo contenenti cellule neurali, comprese le cellule staminali neurali proliferate marcate con EdU, un analogo della timidina.

Delineare le sezioni con una marcatura idrofobica per prevenire la diffusione della soluzione.

Aggiungere un detergente per permeabilizzare il tessuto. Lavare per rimuovere il detersivo in eccesso.

Aggiungi un fluoroforo per etichettare l'EdU. Rimuovere i fluorofori in eccesso.

Utilizzando un microscopio a fluorescenza, confermare la corretta colorazione delle cellule marcate con EdU.

Applicare un tampone bloccante contenente proteine per prevenire il legame di anticorpi non specifici. Elimina le proteine in eccesso.

Incubare con anticorpi primari che si legano a proteine specifiche nelle cellule staminali neurali. Rimuovere gli anticorpi non legati.

Aggiungere anticorpi secondari coniugati con fluorofori per legare gli anticorpi primari. Lavare via gli anticorpi non legati.

Colorare i nuclei con un colorante e rimuovere il colorante in eccesso.

Rimuovere la marcatura idrofobica, applicare il supporto di montaggio e posizionare un vetrino coprioggetti.

Utilizzando un microscopio confocale, osservare le sezioni per visualizzare le cellule staminali neurali marcate.

Per colorare le sezioni di tessuto con l'analogo della timidina, rimuovere le sezioni di tessuto dal tampone citrato. Lasciare asciugare le sezioni di tessuto e aderire completamente ai vetrini prima di disegnare un bordo con una penna idrofoba. Quindi, permeabilizzare le sezioni con un tampone di permeabilizzazione per 20-30 minuti. Lavare le sezioni due volte con TBS Triton per 5 minuti ciascuna. Quindi, preparare una soluzione di reazione EdU.

Incubare le sezioni in una soluzione di reazione EdU per 30 minuti o un'ora. Successivamente, lavateli tre volte in TBS Triton per 5 minuti ogni volta. A questo punto, controlla se la reazione EdU funziona utilizzando un microscopio a fluorescenza. Se la reazione funziona, le cellule marcate con EdU devono essere osservate. Ora, bloccare le sezioni di tessuto montate utilizzando il tampone bloccante sollevato nello stesso animale dell'anticorpo secondario per 30 minuti a un'ora. Quindi, lavateli due volte in TBS Triton per 5 minuti ogni volta.

Durante la fase di blocco, preparare la soluzione di anticorpi primari mescolando l'anticorpo primario nel tampone di blocco. Successivamente, aggiungere 250 microlitri di soluzione di anticorpi primari per vetrino per assicurarsi che le sezioni di tessuto siano completamente sommerse e incubarle per una notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, lavare le sezioni di tessuto tre volte in TBS Triton per 5 minuti ciascuna per rimuovere l'eccesso di anticorpi primari.

Quindi, incubare le sezioni di tessuto in un anticorpo secondario coniugato con fluorofori preparato in una soluzione tampone bloccante per due ore a temperatura ambiente. Lavare le sezioni di tessuto tre volte in TBS Triton per 5 minuti ciascuna per rimuovere l'eccesso di anticorpi secondari. Successivamente, applicare 300 micromolari di soluzione DAPI a 1-100 in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare le sezioni di tessuto tre volte in PBS per cinque minuti ciascuna per rimuovere il DAPI in eccesso e rimuovere il cerchio della penna PAP attorno al tessuto utilizzando un batuffolo di cotone. Lasciare asciugare le sezioni prima di applicare il supporto di montaggio e coprirle con vetrini.