Danneggiare meccanicamente i nervi segmentali delle larve di Drosophila per indurre la neurodegenerazione

Prendi le larve di Drosophila di terzo stadio e anestetizzale usando l'anidride carbonica.

Al microscopio, posizionare le larve con la superficie ventrale rivolta verso l'alto per visualizzare i nervi segmentali.

Questi nervi contengono motoneuroni che innervano i muscoli della parete corporea e controllano il movimento larvale.

I terminali assonici di questi neuroni si collegano con le fibre muscolari per formare giunzioni neuromuscolari o NMJ.

I neuroni rilasciano neurotrasmettitori che si legano ai recettori sulle fibre muscolari, causando l'afflusso di ioni e innescando la trasmissione del segnale.

Usando una pinza, pizzicare la cuticola ventrale per ferire i nervi segmentali, inibendo così il movimento.

Metti le larve ferite su un piatto di agar con cibo larvale per garantire la sopravvivenza.

Metti il piatto in un piatto, coprilo con un tovagliolo di carta umido per mantenere l'umidità e conservalo in un contenitore per consentire il recupero delle larve.

Con il tempo, la lesione porta alla morte del motoneurone, nota come neurodegenerazione, che interrompe gli NMJ.

Posizionare ogni larva su un apparecchio anestetizzante di CO₂. Sotto un microscopio da dissezione, arrotolare con cura ogni larva sul lato dorsale per visualizzare i nervi segmentali in tutta la cuticola.

È essenziale far rotolare con cura ogni larva sul lato dorsale per visualizzare i nervi segmentali attraverso la cuticola prima della lesione.

Partendo dai ganci della bocca, posizionare una pinza di dimensioni 5 a circa metà a 2/3 della lunghezza delle larve. Una volta posizionato, pizzicare circa un terzo della cuticola ventrale contenente i nervi segmentali con una pinza di misura 5. Per garantire che i nervi segmentali larvali siano danneggiati, applicare una forza sufficiente per schiacciare i nervi segmentali, ma lasciare intatta la cuticola. Per determinare la corretta quantità di forza, schiacciare 10 larve e assicurarsi che il tasso di mortalità dopo cinque ore sia inferiore al 50%.

Dopo la lesione, trasferire con cura le larve su una piastra agar per succo di frutta contenente circa 0,5 grammi di pasta di lievito. Posiziona ogni larva in modo che la sua estremità anteriore sia sulla pasta di lievito per continuare l'alimentazione. Posizionare le piastre di agar contenenti pasta di lievito e 10 larve ferite sul fondo di una capsula di Petri vuota di 100 x 15 millimetri. Copri la capsula di Petri con un tovagliolo di carta umido, assicurandoti che il tovagliolo di carta non tocchi le larve o le piastre di agar. Quindi, metti la capsula di Petri in un contenitore ermetico a temperatura ambiente. Infine, recuperare le larve per la dissezione dopo periodi specificati dopo l'infortunio.