Generazione di organoidi neuronali dopaminergici da cellule staminali embrionali umane

Prendi le cellule staminali embrionali umane, o hESC, in un pallone rivestito di matrice extracellulare.

Sostituire il terreno con un mezzo di induzione neurale e incubare, differenziando le hESC in colonie di cellule progenitrici neurali, o NPC.

Aggiungere una soluzione enzimatica per dissociare le colonie.

Centrifugare, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in un mezzo di induzione con fattori di crescita per supportare la differenziazione delle NPC.

Aggiungere la sospensione cellulare su micropozzetti di forma piramidale inversa per formare neurosfere tridimensionali.

Trasferire le neurosfere su una piastra rivestita di matrice extracellulare contenente un mezzo di differenziazione con fattori di crescita e piccole molecole. Incubare sotto agitazione per promuovere la differenziazione in neuroni progenitori dopaminergici.

Sostituire il terreno con un terreno di maturazione neurale e posizionare le neurosfere su un disco di membrana in un inserto a pozzetto di coltura, consentendo la diffusione di aria e sostanze nutritive.

Incubare in condizioni statiche per formare organoidi tridimensionali costituiti da neuroni dopaminergici maturi.

Questi organoidi, che imitano un cervello in via di sviluppo, sono utili per studiare la degenerazione dei neuroni dopaminergici, una caratteristica del morbo di Parkinson.

Sostituire il terreno di coltura delle cellule staminali utilizzato per mantenere le caratteristiche di pluripotenza delle hESC, con un terreno privo di siero contenente un doppio cocktail di inibizione SMAD per avviare l'induzione neurale e 10 inibitori micromolari di ROCK per aumentare il tasso di sopravvivenza delle cellule durante il passaggio il giorno successivo. Il primo giorno, preparare la piastra per micropozzetti con 2,5 millilitri per pozzetto di terreno privo di siero contenente la stessa concentrazione di inibitore ROCK e doppie molecole di inibizione SMAD.

Per differenziare le cellule verso il pattern ventrale del tubo neurale, aggiungere SHH e FGF8 a 100 nanogrammi per millilitro e due agonisti levigati micromolari. Dopo aver aggiunto il terreno, centrifugare la piastra a 1.200 volte g per cinque minuti per rimuovere le bolle d'aria dai micropozzetti. Una volta che la piastra per micropozzetti è pronta per l'uso con mezzo mezzo di differenziazione, rimuovere il terreno di hESC e lavare rapidamente con PBS privo di cloruro di calcio e magnesio.

Dissociare le colonie in una sospensione unicellulare aggiungendo 7,5 mL di soluzione enzimatica ricombinante in un pallone T75. Incubare le cellule per due minuti a 37 gradi Celsius, quindi aggiungere 7,5 di DMEM F-12. Successivamente, raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 300 volte g per cinque minuti. Quindi, rimuovere il surnatante e contare le cellule nello stesso terreno utilizzato per preparare la piastra a micropozzetti.

Regolare il volume del terreno per ottenere una sospensione cellulare, che permetta di formare neurosfere contenenti 1.000 cellule per micropozzetto, preparando 4,7 milioni di cellule in 2,5 millilitri di terreno e aggiungendolo ai precedenti 2,5 millilitri di terreno già inseriti nella piastra. Per distribuire correttamente le cellule in ogni micropozzetto, agitare delicatamente la piastra e centrifugarla a 300 volte g per cinque minuti. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 24 ore per generare sfere.

Il secondo giorno, sciacquare delicatamente i micropozzetti con il terreno e trasferire le sfere in una piastra a sei pozzetti trattata con tessuti. Posizionare le sfere in rotazione a 37 gradi Celsius e cambiare metà del terreno con terreno fresco ogni due o tre giorni. Dal 3° al 13° giorno, per migliorare l'induzione neurale e convertirla in progenitori neurali con un'identità mesencefalica, integrare il terreno con tre inibitori micromolari di GSK-3-beta. Dividere il campione in due nuove piastre a sei pozzetti trattate con tessuto per ridurre la densità della sfera ed evitare l'aggregazione della sfera.

L'ottavo giorno, inizia la maturazione neurale passando a un nuovo terreno con fattori di crescita e cambia il terreno ogni due o tre giorni. Il giorno 21, posizionare un inserto per piastra di coltura in un pozzetto di una nuova piastra a sei pozzetti e aggiungere 1,2 millilitri di terreno di maturazione neurale utilizzato per la differenziazione della neurosfera sotto l'inserto della membrana. Quindi, deporre la membrana in PTFE su un inserto della piastra di coltura.

Infine, per generare l'organoide neurale, seminare circa 100 neurosfere in condizioni di interfaccia aria-liquido sulla membrana in PTFE. Interrompere la rotazione da questo passaggio e cambiare il fluido ogni due o tre giorni fino a raggiungere il punto temporale di differenziazione richiesto.