JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:13 min • July 8th, 2025
Iniziate con un ratto anestetizzato, disinfettate la sua testa rasata e fissatela in un apparecchio stereotassico.
Fai un'incisione sulla linea mediana per esporre il cranio.
Segna due posizioni sul cranio e pratica piccoli fori.
Collegare una siringa con virus chimerici contenenti RNA ecotropico dell'HIV all'interno di un vettore lentivirale all'apparato stereotassico.
Inserisci l'ago nel foro, mirando alle cellule della corteccia cerebrale, inclusa la microglia, le cellule immunitarie del cervello.
Iniettare lentamente i virus per la loro distribuzione uniforme nella corteccia.
Dopo l'iniezione, sutura l'incisione, disinfetta l'area e consenti al ratto di riprendersi.
Il virus iniettato interagisce con i recettori delle cellule cerebrali, si fonde e rilascia l'RNA dell'HIV nel citoplasma.
L'RNA viene trascritto inversamente in DNA e si integra nel DNA della cellula.
La cellula infetta esprime i componenti virali, producendo nuovo RNA e proteine.
Questi si assemblano e vengono rilasciati come nuovi virus, che aumentano la carica virale nel cervello, stabilendo un'infezione attiva da HIV.
Per l'iniezione di EGFP EcoHIV, dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, radere i peli dalla regione cerebrale e sterilizzare la pelle esposta 2 volte con etanolo al 70% e uno scrub a base di clorexidina. Fissare il ratto in posizione prona in un apparato stereotassico e praticare un'incisione di 5-6 centimetri attraverso la pelle lungo la linea mediana del cuoio capelluto.
Segnare una posizione di perforazione a 0,8 millimetri lateralmente e una a 1,2 millimetri rostrale a bregma e praticare un foro di 0,4 millimetri di diametro in ciascuna posizione del cranio. Caricare da 1,04 volte 10 alla sesta unità di trasduzione per millilitro di soluzione titolata di EcoHIV Lentivirus in una siringa per iniezione da 10 microlitri e fissare la siringa all'apparato stereotassico.
Spostare l'ago vicino alla superficie di un foro e inserire l'ago di 2,5 millimetri nel foro. Infondere 1 microlitro di soluzione virale alla velocità di 0,2 microlitri di virus al minuto. Quando tutto il virus è stato iniettato, lasciare l'ago all'interno dell'area di iniezione per cinque minuti prima di ritrarre lentamente l'ago fino a quando non si trova all'esterno del cranio del ratto.
Chiudere l'incisione cutanea con una sutura a filo di seta 4-0 e sterilizzare la soluzione con etanolo al 70%. Quindi, posizionare il ratto in una camera di recupero con un termoforo con monitoraggio fino alla decubito.