JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:29 min. • July 8th, 2025
Inizia con una piastra di coltura contenente embrioni fecondati di pesce zebra in un mezzo embrionale.
Posizionare la capsula sotto uno stereomicroscopio e utilizzare una pinza di dissezione per rimuovere il corion, la membrana esterna che circonda gli embrioni.
Ciò consente agli embrioni di essere esposti al terreno circostante.
Trasferisci questi embrioni dechorionati in un piatto contenente terreno embrionale con un farmaco che inibisce la sintesi del colesterolo, che è fondamentale per mantenere l'integrità dei vasi sanguigni del cervello.
Incubare a temperatura controllata fino a quando gli embrioni non si sviluppano in larve.
Nel tempo, il farmaco permea le larve in via di sviluppo, inibendo la sintesi del colesterolo.
La carenza di colesterolo indebolisce i vasi sanguigni del cervello, causandone la rottura e la fuoriuscita di sangue nel cervello, sviluppando macchie emorragiche.
Osservare le larve al microscopio stereoscopico.
Separare le larve emorragiche, con macchie rosse distinte, da una popolazione non emorragica.
Trasferisci queste larve emorragiche in un nuovo piatto per ulteriori studi.
A 24 ore dalla fecondazione, sotto uno stereomicroscopio a campo chiaro, utilizzare una pinza di dissezione ultrasottile affilata per de-corionato gli embrioni per il trattamento con atorvastatina. Quindi, aggiungere 30 millilitri di terreno embrionale E3 a due piastre di Petri pulite, una per il trattamento e l'altra per il controllo. Rimuovere 60 microlitri di acqua embrionale dalla capsula di trattamento e aggiungere 60 microlitri di atorvastatina 0,5 millimolare per ottenere l'80% delle larve emorragiche.
Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire 100 embrioni in meno acqua possibile in ogni piatto. Incubare le due piastre a 28 gradi Celsius. In qualsiasi momento dopo 50 ore dalla fecondazione, al microscopio, utilizzare una pipetta Pasteur per separare accuratamente i pesci emorragici dalle popolazioni non emorragiche e trasferire le larve in nuovi piatti contenenti terreni E3 freschi.
Per facilitare la separazione delle larve positive all'emorragia, è possibile utilizzare pesci senza pigmento o pesci che esprimono proteine fluorescenti nei globuli rossi.