JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:27 min. • July 8th, 2025
Prendiamo le cellule staminali neurali primarie e progenitrici e i neuroni, che hanno sialoglicoproteine marcate da un reporter di acido sialico.
Aggiungere paraformaldeide per fissare le cellule. Rimuovere la paraformaldeide in eccesso utilizzando il tampone.
Incubare con una miscela di reazione contenente sonde chimiche a base di biotina, un agente riducente e un catalizzatore a base di metallo.
L'agente riducente attiva il catalizzatore, facilitando la biotinilazione delle sialoglicoproteine.
Rimuovere la miscela di reazione e lavare con tampone. Aggiungere streptavidina fluoroforiosa coniugata per legare le sialoglicoproteine biotinilate.
Rimuovere la streptavidina non legata e lavare con tampone. Aggiungi proteine e un detergente non ionico per bloccare siti non specifici e permeabilizzare le cellule.
Rimuovere questa soluzione e incubare con anticorpi primari mirati a specifiche proteine cellulari.
Rimuovere gli anticorpi non legati.
Incubare con anticorpi secondari marcati con fluorofori e un colorante fluorescente per legare gli anticorpi primari legati alle proteine e marcare i nuclei.
Rimuovi le molecole non legate. Lavare con tampone.
Utilizzando la microscopia a fluores
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