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Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:18 min. • July 8th, 2025
Inizia con un vetrino di coltura a più pozzetti contenente neuroni da un embrione di topo in un terreno.
I neuroni mostrano coni di crescita sulla punta dei loro assoni in crescita. Queste strutture includono sottili sporgenze chiamate filopodi ed estensioni simili a fogli chiamate lamellopodi, che consistono in filamenti di actina e microtubuli, componenti del citoscheletro.
Trattare i pozzetti del test con la proteina amiloide-β aggregata, o Aβ, e i pozzetti di controllo con una soluzione veicolo.
Nei pozzetti di test, l'Aβ aggregato si lega ai recettori di membrana, avviando a valle la segnalazione che fosforila le proteine che regolano il citoscheletro.
Le proteine fosforilate distruggono i filamenti di actina e i microtubuli, destabilizzando l'integrità strutturale del cono di crescita e causandone il collasso.
Incubare con un fissativo per preservare la struttura cellulare, quindi lavare le cellule e montarle per l'imaging.
Utilizzando un microscopio, confrontare le strutture cellulari nei pozzetti di test e controllo.
Un aumento dell'incidenza del collasso del cono di crescita nei neuroni trattati con Aβ indica l'effetto tossico degli aggregati di Aβ.
Iniziare questo test con almeno una settimana di anticipo aprendo una nuova fiala di A-beta-42 a lunghezza intera ottenuta in commercio e sciogliendo il contenuto in acqua distillata sterile a una concentrazione di 0,5 millimolari. Incubare a 37 gradi Celsius per sette giorni per indurre aggregazione e tossicità. Preparare aliquote di A-beta-42 aggregato e conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso.
Il quarto giorno della coltura neuronale, trattare i pozzetti con 100 microlitri di A-beta-42 aggregato 0,5 micromolare o soluzione veicolo in mezzo B per un'ora, come precedentemente dimostrato. Trascorso l'ora, rimuovere il terreno di coltura e fissare immediatamente i neuroni con paraformaldeide al 4% contenente il 4% di saccarosio in PBS per un'ora a 37 gradi Celsius su una piastra calda.
La fissazione è importante soprattutto in quanto mantenere la forma dei coni di crescita è fondamentale per questo protocollo.
Dopo la fissazione, lavare i neuroni tre volte con PBS. Quindi, dopo aver rimosso la camera, montare i neuroni con un mezzo di montaggio acquoso. Asciugare il mezzo di montaggio a 4 gradi Celsius per due o quattro giorni. Cattura l'intera area di ogni pozzetto con un obiettivo a secco 20x su un microscopio invertito.
Catturare e analizzare l'intera area in ogni pozzo è importante per evitare la soggettività.
Classificare i neuriti più lunghi di ciascun neurone allo stadio 3 o 4 come assoni. I coni di crescita assonale privi di lamellipodi o che possiedono meno di tre filopodi sono considerati coni di crescita collassati.