Visualizzazione dei peptidi beta-amiloidi in fette di cervello corticale umano

Prendete un vetrino contenente una fetta corticale di tessuto cerebrale prelevato da un malato di Alzheimer. Il tessuto contiene depositi di beta-amiloide insolubili all'interno del parenchima e dei capillari cerebrali.

Immergere il vetrino in alcool diluito per rimuovere lipidi e sali.

Lavare con alcool assoluto per disidratare il tessuto, quindi applicare un fissativo per preservare l'architettura dei tessuti.

Asciugare il vetrino con l'aspirapolvere, rimuovendo l'umidità.

Trattare con vapore di acido formico in un ambiente umidificato per scomporre gli aggregati di amiloide-beta in peptidi solubili più piccoli.

Utilizzando uno scanner ottico, genera immagini delle caratteristiche strutturali del tessuto per interpretare i dati della spettrometria di massa per immagini.

Spruzzare una soluzione di matrice sul campione.

Utilizzando uno spettrometro di massa, applicare un laser che la matrice assorbe per ionizzare i peptidi. Un rivelatore li identifica quindi in base al loro rapporto massa/carica.

Analizza i dati per produrre immagini che rivelano la distribuzione dei peptidi beta-amiloidi nel parenchima tissutale e nei capillari cerebrali.

Per risciacquare le sezioni di tessuto, immergere i campioni in 40-100 millilitri di etanolo al 70% in un barattolo di vetro per 30 secondi per rimuovere i lipidi endogeni e i sali inorganici. Lavare i campioni utilizzando la sequenza di lavaggio elencata nel protocollo di testo. Quindi, asciugare i campioni sotto vuoto per 30 minuti.

Ora, trattare le sezioni di tessuto con un vapore di acido formico per una migliore ionizzazione delle proteine amiloide-beta dal tessuto cerebrale autoptico. Per fare ciò, prepara il forno a 60 gradi Celsius e una pirofila di vetro per incubazione con 5 millilitri di acido formico al 100%. Mantenere l'umidità dell'aria nella capsula di vetro per l'incubazione al livello di saturazione.

Posizionare i vetrini di tessuto nella capsula di vetro per l'incubazione evitando l'immersione nell'acido formico e trattare per sei minuti. Acquisire un'immagine ottica dei campioni utilizzando uno scanner per pellicole, uno scanner per gel o un microscopio digitale. Eseguire questo passaggio a temperatura ambiente.

L'allineamento dell'immagine ottica dei campioni è necessario quando il target del campione è posizionato all'interno dello strumento. Di solito, non sarà possibile riconoscere la sezione di tessuto sotto lo strato della matrice. Per correlare le immagini ottiche con i campioni, tracciare dei segni guida visibili sia nell'immagine ottica che sotto lo strato della matrice nell'ottica della fotocamera. Il modo più semplice è individuare almeno tre segni di liquido correttivo attorno al campione prima di scattare l'immagine ottica.

Per spruzzare la matrice con uno spruzzatore a ultrasuoni, rimuovere il tessuto da spruzzare dall'essiccatore e posizionarlo nella camera. Assicurarsi che il fazzoletto non copra la finestra del sensore. Avviare la preparazione premendo il pulsante Start. Di solito, il tempo di preparazione è di circa 90 minuti.

La preparazione sarà regolata automaticamente tramite il monitoraggio dello spessore dello strato di matrice e dell'umidità. In alternativa, per spruzzare la soluzione della matrice sulla superficie del tessuto con uno spruzzatore automatico, utilizzare un sistema di pompaggio del solvente impostato a 10 PSI e 0,15 millilitri al minuto per erogare la soluzione della matrice.

Un flusso costante di gas di guaina riscaldata verrà erogato insieme allo spray della soluzione della matrice. Esegui esperimenti di imaging ad alta produttività e alta risoluzione spaziale con MALDI-IMS. Per le misure di spettrometria di massa, definire le aree tissutali utilizzando il software di controllo MALDI e il software di analisi dei dati.

Acquisisci spettri in modalità lineare positiva con un intervallo del rapporto massa-carica compreso tra 2.000 e 20.000 e una risoluzione spaziale di 20 e 100 micron. Per creare lo standard di calibrazione, sciogliere lo standard di calibrazione dei peptidi nello standard di calibrazione delle proteine in un rapporto da 1 a 4 con CHCA in soluzione TA30, quindi diluirlo 10 volte.

Posizionare 1 microlitro di standard di calibrazione sul vetrino in quattro posizioni diverse. Utilizzando un software di istologia molecolare, sovrapporre più immagini di segnale per trovare la correlazione spaziale di vari segnali, come diversi peptidi amiloide-beta che co-localizzano nelle placche senili nelle pareti arteriose.