Rilevamento di microemorragie cerebrali in un modello di ratto

Le microemorragie cerebrali, o CMH, sono emorragie cerebrali neuroinfiammatorie causate dall'interruzione della barriera emato-encefalica, con conseguente fuoriuscita di globuli rossi, o RBC, nel tessuto cerebrale.

Per rilevare le CMH, iniziare con il tessuto cerebrale fisso di un ratto con CMH.

Immergere il tessuto nel saccarosio per la crioprotezione.

Utilizzando un crio-microtomo, sezionare il tessuto e raccogliere una sezione su un vetrino.

Lavare per rimuovere il fissativo residuo.

Applicare il colorante ematossilina legato a un catione metallico che interagisce con il DNA caricato negativamente, colorando il nucleo di colore rossastro-violaceo.

Seguire con acido-alcol per rimuovere il colorante in eccesso, quindi applicare un agente azzurrante alcalino per neutralizzare l'ambiente acido e convertire il colorante nella sua forma blu, migliorando il contrasto.

Lavare il tessuto con alcool per migliorare la penetrazione delle macchie, quindi applicare l'eosina per colorare i globuli rossi rosso-arancio e i componenti del tessuto di rosa.

Disidratare il tessuto utilizzando concentrazioni crescenti di alcol e pulirlo con xilene per la visualizzazione microscopica.

Acquisisci immagini per rilevare i globuli rossi di colore rosso-arancio trapelati, confermando i CMH.

Dopo aver isolato il cervello, immergerlo nel 20% di saccarosio in PBS per almeno sei ore o fino a quando il cervello non affonda sul fondo del tubo. Cambia la soluzione con il saccarosio al 30% e fissala per altre sei ore.

Infine, preparare sezioni di tessuto cerebrale spesse 10 millimetri utilizzando un criostato. Iniziare la colorazione H&E lavando i vetrini in acqua distillata. Quindi, immergere in una soluzione di ematossilina per otto minuti. Dopo la colorazione, lavare in acqua corrente per cinque minuti. Differenziare in alcol-acido all'1% per 30 secondi.

Dopo il lavaggio in acqua corrente per un minuto, colorare con acqua di ammoniaca allo 0,2% o soluzione satura di carbonato di litio per 30 secondi a un minuto. Quindi, lavare in acqua corrente per cinque minuti. Controcolorare con la soluzione di eosina per 30 secondi a un minuto. Disidratare con alcol al 90%, quindi alcol al 95% e alcol assoluto per 0,5-2 minuti ciascuno.

Dopo la disidratazione, lasciare in xilene per 30 secondi. Dopo il montaggio, analizzare la colorazione H&E utilizzando un microscopio a fluorescenza a campo chiaro. I globuli rossi rilasciati dai vasi sanguigni, che sono componenti dei CMH, appaiono in rosso-arancio sotto la colorazione H&E.