JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:53 min. • July 8th, 2025
Iniziare con un vetrino coprioggetti contenente neuroni in coltura che esprimono proteine della membrana delle vescicole sinaptiche, tra cui sinaptofisina e sinaptotagmina-1 marcate con fluorescenza.
Rimuovere il terreno, aggiungere una miscela di tampone di depolarizzazione e anticorpi primari, quindi incubare.
Gli ioni tampone entrano nelle cellule, stimolando la fusione delle vescicole sinaptiche con la membrana, che espone la sinaptotagmina-1.
Gli anticorpi primari si legano selettivamente alla sinaptotagmina-1 esposta.
Eliminare il tampone e lavare con il terreno per rimuovere gli anticorpi non legati.
Introdurre terreno fresco e incubare per facilitare l'internalizzazione della membrana, formando vescicole riciclate con sinaptofisina marcata e sinaptotagmina-1 legata agli anticorpi.
Rimuovere il terreno, fissare le celle e lavare.
Introdurre un tampone bloccante a base di detergente con anticorpi secondari accoppiati a fluoroforo.
Il detergente permeabilizza le cellule, consentendo agli anticorpi secondari di interagire con la sinaptotagmina-1 legata agli anticorpi.
Sollevare il vetrino, lavarlo con acqua e asciugarlo.
Posizionare il vetrino coprioggetti a faccia in giù su un
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici