JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:25 min • July 8th, 2025
Inizia con una coltura di neuroni aderenti trattata con aggregati alfa-sinucleina o alfa-S, che sono grumi di una proteina mal ripiegata.
Questi grumi si aggregano per formare inclusioni intracellulari.
Sostituire il supporto con una soluzione di fissaggio per preservare l'integrità cellulare.
Rimuovere la soluzione fissante e lavare con tampone.
Successivamente, aggiungi un tensioattivo per permeabilizzare la membrana cellulare.
Rimuovere il tensioattivo e lavare con tampone.
Introdurre una soluzione bloccante per prevenire il legame di anticorpi non specifici.
Ora, incubare con anticorpi primari che si legano specificamente alle inclusioni alfa-S e alle proteine strutturali.
Lavare con tampone per rimuovere gli anticorpi non legati.
Incubare con anticorpi secondari marcati in fluorescenza.
Rimuovere gli anticorpi non legati.
Aggiungi una macchia fluorescente per etichettare il nucleo.
Rimuovere la macchia e lavare con tampone.
Utilizzando i supporti di montaggio, montare il vetrino coprioggetti con i neuroni su un vetrino.
Sotto un microscopio a fluorescenza, osservare le inclusioni alfa-S immunomarcate all'interno del neurone.
Per eseguire l'immunofluorescenza in una cappa chimica, fissare i neuroni con paraformaldeide al 2% in PBS e soluzione di saccarosio al 5% per 15 minuti a temperatura ambiente senza agitare. Dopo 15 minuti, rimuovere la soluzione fissante e lavare brevemente i neuroni con PBS tre volte.
Successivamente, permeabilizzare i neuroni con lo 0,3% di tensioattivo non ionico in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare brevemente i neuroni con PBS tre volte. Incubare i neuroni con il 3% di FBS in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente su uno shaker orbitale per bloccare i siti di legame non specifici. Successivamente, incubare i neuroni con un anticorpo primario appropriato disciolto in FBS al 3% in PBS per una notte nella cella frigorifera o in frigorifero per una notte a 4 gradi Celsius su uno shaker orbitale.
Il giorno successivo, rimuovere la soluzione anticorpale e lavare brevemente le cellule con PBS per tre volte. Quindi, incubare i neuroni con l'appropriato anticorpo secondario fluorescente disciolto in FBS al 3% in PBS per 1 ora a temperatura ambiente al buio su uno shaker orbitale.
Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare brevemente con PBS per tre volte. Quindi, colorare i neuroni con la soluzione DAPI per 15 minuti a temperatura ambiente al buio su uno shaker orbitale. Dopo 15 minuti, rimuovere la soluzione anticorpale e lavare brevemente con PBS per tre volte. Montare i vetrini coprioggetti sul vetrino utilizzando un mezzo di montaggio anti-sbiadimento.