Un modello in vitro di lesione da stiramento in neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:33 min • July 8th, 2025
Inizia con una piastra senza fondo a più pozzetti attaccata a una membrana di silicone. La membrana è rivestita con un biopolimero per facilitare l'adesione cellulare.
Introdurre nei pozzetti neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane, o hiPSCN, sospesi in un mezzo. Il terreno è integrato con matrice extracellulare o proteine ECM per migliorare l'adesione cellulare.
Incubare la piastra, permettendo alle cellule di aderire alle proteine della ECM e al biopolimero, favorendo un'interazione uniforme con la superficie della membrana.
Quindi, fissare la placca sul tavolino di un dispositivo per lesioni.
Utilizzando il dispositivo, applicare una rientranza sulla membrana per generare uno stress meccanico controllato sui neuroni.
Lo stress interrompe il citoscheletro, causando la degenerazione delle sporgenze cellulari chiamate neuriti e la formazione di piccoli rigonfiamenti lungo i neuriti.
Lo stress danneggia anche l'integrità della membrana cellulare, con conseguente morte cellulare.
Gli hiPSCN che mostrano un fenotipo di lesione da stiramento sono ora pronti per l'analisi.
Per allungare la piastra, modificare i campi "Nome file" e "Percorso file" nello strumento virtuale "Rilevamento posizione" con un nome file univoco e fare clic sulla freccia Esegui. Impostare la profondità e la durata dell'impronta nei campi "Infortunio" e "Durata infortunio" nello strumento virtuale del pannello di controllo del movimento. Con la piastra in posizione zero, eseguire lo strumento virtuale "Pannello di controllo del movimento" e fare clic su Lesione per far rientrare la piastra.
Fare clic su Superiore per spostare il palco verso l'alto, fare clic su Stop quando la piastra è nella posizione superiore e aprire la porta per disattivare il dispositivo di lesione. Quindi, ispezionare la cronologia degli spostamenti dello stadio presentata nello strumento virtuale "Position Tracker" per confermare che è stato applicato lo spostamento massimo specificato ed esportare i dati in un programma di fogli di calcolo appropriato.
Per valutare l'allungamento della membrana siliconica dopo il trattamento al plasma, posizionare la lastra su una superficie morbida e adescare la piccola sporgenza su un timbro con inchiostro da pennarello indelebile. Inserire il timbro nel primo pozzetto da testare e picchiettare per garantire un buon trasferimento dell'inchiostro. Quando tutti i pozzetti sono stati timbrati, posizionare una telecamera ad alta velocità su un supporto del braccio sopra il dispositivo di lesione, con l'obiettivo impostato sul più piccolo F-stop numerato in modo che il campo visivo contenga 12 penetratori in una griglia 3 per 4.
Con la piastra nella posizione del punto zero, fare clic sul pulsante Registra sul software della fotocamera in modo che legga "Trigger In" e accenda la luce assiale intensa e diffusa, quindi rientri la piastra come appena dimostrato e spegni la luce assiale.
Per danneggiare una coltura cellulare, aggiungere 100 microlitri di neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane trattate con laminina a ciascun pozzetto della piastra trattata al plasma e lasciare che le cellule si attacchino al fondo della piastra per 15 minuti a temperatura ambiente, prima di posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Dopo 2 o 3 giorni di coltura, bloccare la piastra sul tavolino del dispositivo per lesioni e regolare la posizione del coperchio per fissare la piastra senza esporre le colture all'aria ambiente. Quindi, con la piastra nella posizione del punto zero, indentare la piastra come appena dimostrato.
Panoramica
In questo articolo viene descritto un metodo per indurre stress meccanico su neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCNs) al fine di studiare le risposte cellulari. Il processo prevede l'utilizzo di una piastra multipozzetto con una membrana di silicone per applicare un'indentazione controllata, simulando un danno da stiramento.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Mecanobiologia
Sfondo
- Le hiPSCNs sono preziose per lo studio del comportamento neuronale e delle risposte alle lesioni.
- Lo stress meccanico può alterare le strutture cellulari, fornendo informazioni sui meccanismi lesivi.
- Comprendere questi processi è fondamentale per sviluppare strategie terapeutiche per le malattie neurodegenerative.
- L'uso di biopolimeri e proteine della matrice extracellulare migliora l'adesione cellulare, garantendo coerenza sperimentale.
Scopo dello studio
- Studiare gli effetti dello stress meccanico sui neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCNs).
- Analizzare i conseguenti cambiamenti cellulari, inclusa la disorganizzazione del citoscheletro e la morte cellulare.
- Stabilire un metodo riproducibile per lo studio del danno neuronale in vitro.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di una piastra multipozzetto con membrana in silicone e rivestimento di biopolimeri.
- Introduzione di hiPSCNs sospese in un mezzo supplementato con proteine della matrice extracellulare (ECM).
- Applicazione di una forza meccanica controllata mediante un dispositivo per lesione.
- Valutazione delle risposte cellulari mediante imaging e analisi dei dati.
Risultati principali
- Lo stress meccanico ha portato alla degenerazione dei neuriti e alla morte cellulare nei neuroni derivati da hiPSC.
- Sono state osservate modifiche nella morfologia cellulare dopo la lesione.
- I dati hanno confermato l'efficacia del modello di lesione per lo studio delle risposte neuronali.
- L'imaging ad alta velocità ha fornito informazioni sulle dinamiche della lesione cellulare.
Conclusioni
- Lo studio dimostra con successo un metodo per indurre e analizzare lesioni da stiramento nei neuroni derivati da iPSC umani.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei meccanismi cellulari alla base del danno neuronale.
- Questo modello può essere utilizzato per future ricerche sulle malattie neurodegenerative e sulle terapie potenziali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La modellizzazione del danno da stiramento in neuroni derivati da iPSC umane consente una riduzione precoce dei rischi associati a bersagli di neurotrauma e supporta una valutazione predittiva dei meccanismi di lesione neuronale. Questo sistema in vitro fornisce una piattaforma scalabile e rilevante per l'uomo per analizzare le risposte cellulari allo stress meccanico, contribuendo alla validazione dei bersagli e alla ricerca traslazionale. I suoi risultati quantitativi facilitano le decisioni di portafoglio nei percorsi di ricerca sulla neurodegenerazione e sulle lesioni del sistema nervoso centrale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi meccanicistica dei percorsi di danno neuronale in un sistema controllato basato su cellule umane.
- Consente la validazione funzionale di bersagli quantificando la rottura del citoscheletro e i fenotipi di morte cellulare.
- Facilita una previsione affidabile nei programmi precoci di neurotrauma e neurodegenerazione.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un formato multi-pozzetto riproducibile per l'induzione e l'analisi standardizzata delle lesioni.
- Genera letture quantitative adatte allo sviluppo di saggi e flussi di lavoro per lo screening di composti.
- Consente scalabilità e riutilizzo della piattaforma per lo screening ad alto contenuto di agenti neuroprotettivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea ai meccanismi di lesione rilevanti per la malattia osservati nel trauma cranico e nella neurodegenerazione.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica modellando le risposte neuronali umane.
- Supporta l' avanzamento mirato al rischio dei candidati neuroterapeutici basandosi su dati pertinenti all'uomo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello di lesione da stiramento in vitro si inserisce nel percorso che va dalla scoperta precoce alla fase preclinica, fungendo da ponte tra la validazione degli obiettivi terapeutici e la ricerca traslazionale nei percorsi di studio delle lesioni del sistema nervoso centrale e della neurodegenerazione.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi sui fenotipi neuronali indotti da lesioni e sul coinvolgimento di percorsi molecolari.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi per confrontare gli effetti dei composti sui fenotipi da lesione.
- Analisi: Offre dati di imaging ad alto contenuto informativo e dati sullo spostamento per analisi statistiche solide.
- Ricerca traslazionale: Modella meccanismi di lesione rilevanti per l'uomo al fine di guidare lo sviluppo di biomarcatori e terapie.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma scalabile in pozzetti multipli, adattabile tra diversi gruppi di ricerca in neurobiologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sul danno neuronale.
- Valore operativo: Standardizza l'induzione e l'analisi del danno per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione e riduce il rischio biologico in fase avanzata nei portafogli di neuroterapie.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio dei programmi su lesioni del sistema nervoso centrale e neurodegenerazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di iPSC umane e nella differenziazione neuronale.
- Necessita di strumentazione specializzata per applicare stress meccanici controllati e per l'acquisizione di immagini ad alta velocità.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i parametri di lesione e i flussi di analisi dei dati.
- È adattabile a diversi sottotipi neuronali e gradi di gravità della lesione, previa ottimizzazione del protocollo.
- Le limitazioni includono il contesto in vitro e l'assenza di fattori sistemici presenti in vivo.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Modello di impatto corticale controllato di lesioni cerebrali del topo con trapianto terapeutico di cellule neurali derivate da cellule staminali indotte dall'uomo
Video correlati
0 Visualizzazioni
Produzione automatizzata di neuroni corticali e dopaminergici pluripotenti indotti dall'uomo con monitoraggio integrato delle cellule vive
Video correlati
0 Visualizzazioni
Vena safena umana Isolamento delle cellule endoteliali ed esposizione a livelli controllati di stress da taglio e allungamento
Video correlati
0 Visualizzazioni
Differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in neuroni su array di microelettrodi
Video correlati
0 Visualizzazioni
Induzione in vitro di giunzioni neuromuscolari da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo ingegnerizzate
Video correlati
0 Visualizzazioni
Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane nei neuroni utilizzando lentivirus ingegnerizzati
Video correlati
0 Visualizzazioni
Stretch in microvascolari cerebrali cellule endoteliali (CEND) come
Video correlati
0 Visualizzazioni
Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l'attività di rete su array Micro-elettrodo
Video correlati
0 Visualizzazioni
Metodo per il pregiudizio elasticizzato ad alta velocità dell'essere umano ha indotto i neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti in un formato a 96 pozzetti
Video correlati
0 Visualizzazioni
Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte
Video correlati
0 Visualizzazioni
Ultimo aggiornamento: 29 agosto 2026