JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:56 min. • July 8th, 2025
Inizia con un pesce zebra adulto anestetizzato.
Trasferisci il pesce su un portaspilli in silicone e applica uno strato di polimero sintetico per lubrificare l'occhio.
Quindi, posiziona una lente laser davanti all'occhio per focalizzare un raggio di puntamento laser sulla retina.
Dirigere il laser sull'occhio del pesce zebra, provocando lesioni alla retina.
Il laser induce il danno termico e la morte delle cellule fotorecettrici retiniche, avviando un processo degenerativo che progredisce nell'arco dei giorni e si estende dall'epitelio pigmentato retinico allo strato plessiforme esterno.
In risposta, le cellule della glia di Muller (MG) vanno incontro a gliosi reattiva, diventando ipertrofiche e proliferative.
Queste cellule poi si dedifferenziano in progenitori di cellule staminali.
Le cellule progenitrici migrano gradualmente verso il sito della lesione e, guidate da segnali spaziali e temporali provenienti dal microambiente, si differenziano in tipi di cellule retiniche mature per diversi giorni, facilitando così la rigenerazione della struttura retinica.
Preparare una soluzione madre di anestetico sciogliendo 400 milligrammi di polvere di tricaina in 97,9 millilitri di acqua del serbatoio e 2,1 millilitri di un molare TBS. Regolare a pH 7,0 con un tris molare a pH 9. Per preparare la soluzione di lavoro, diluire la soluzione madre di tricaina da 1 a 25 in acqua del serbatoio e trasferire 50 millilitri in una capsula di Petri. Quindi posizionare il pesce zebra nella soluzione anestetica per 2-5 minuti, fino a quando non diventa immobile e non risponde agli stimoli esterni.
Trasferisci ogni pesce a mano su un portaspilli in silicone su misura per il trattamento laser.
Un'anestesia appropriata è fondamentale per il benessere dell'animale e il successo della procedura. Pertanto, la soluzione di tricaina appena preparata è fondamentale e il tempo fuori dall'acqua non deve superare di molto i 10 minuti.
Impostate la potenza di uscita del laser a diodi a 532 nanometri a 70 milliwatt, la durata dell'impulso a 100 millisecondi e il diametro dell'antenna a 50 micron. Quindi, applicare da 1 a 2 gocce di idrossipropilmetilcellulosa al 2% sull'occhio.
Quando si applica methylcell sull'occhio, assicurarsi che la soluzione viscosa non vada sulle branchie.
Quindi, utilizzare una lente laser del fondo oculare da 2 millimetri per focalizzare il raggio di puntamento laser sulla retina. Posizionare quattro punti laser attorno al nervo ottico dell'occhio sinistro e utilizzare l'occhio destro, non trattato, come controllo interno.