Misurazione dell'attivazione del recettore degli odori utilizzando un saggio ciclico in tempo reale dell'adenosina monofosfato

Prelevare una piastra multipozzetto contenente cellule di mammifero trasfettate.

Queste cellule esprimono il recettore olfattivo (OR) del neurone olfattivo, un recettore accoppiato a proteine G, insieme a un biosensore cAMP contenente un dominio di legame cAMP fuso con una luciferasi mutante.

Rimuovere il fluido e lavare con tampone per rimuovere il mezzo residuo.

Aggiungere un tampone contenente un substrato del biosensore cAMP. Incubare per facilitare l'assorbimento del substrato nelle cellule.

Utilizzando un lettore di piastre a chemiluminescenza, misurare la luminescenza basale delle cellule.

Aggiungere concentrazioni crescenti dell'odorizzante di prova ai pozzetti, lasciando un pozzetto non trattato come controllo.

L'odorizzante si lega all'OR e innesca una cascata di segnalazione che produce cAMP.

Questo cAMP si lega al dominio di legame del biosensore, attivando la luciferasi, che interagisce con il substrato per emettere luce.

Misura la luminescenza in tempo reale. Un aumento della luminescenza con concentrazioni più elevate di odorizzante indica l'attivazione in sala operatoria da parte dell'odorizzante.

Prima della stimolazione, osservare le cellule trasfettate al microsc