Misurazione dei livelli di acido retinoico nelle neurosfere utilizzando una linea cellulare reporter di acido retinoico

Prelevare una coltura aderente di cellule reporter di acido retinoico (RA).

Queste cellule trasportano un costrutto transgenico contenente il gene lacZ, che codifica per la β-galattosidasi, regolata dall'elemento di risposta dell'acido retinoico (RARE).

Cellule dissociate del seme derivate dalle neurosfere delle cellule staminali del midollo spinale di topo. Incubare.

Le cellule della neurosfera rilasciano RA, che entra nelle cellule reporter e si lega al suo complesso recettoriale su RARE.

Questo innesca la formazione di un complesso attivatore trascrizionale, avviando l'espressione della β-galattosidasi.

Sostituire il terreno con un fissativo per preservare la morfologia cellulare.

Rimuovere il fissativo e lavare con un tampone.

Aggiungere un tampone di permeabilizzazione per permeabilizzare le membrane cellulari.

Introdurre un substrato β-galattosidasi e incubare.

Il substrato entra nelle cellule reporter, dove la β-galattosidasi lo idrolizza in un prodotto instabile che si ossida e dimerizza, formando un precipitato di colore blu.

Lavare con un tampone.

Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare l'assorbanza e confrontarla con una curva standard per quantificare la secrez