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Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:58 min • July 8th, 2025
Prendi un tratto gastrointestinale di topo embrionale fisso e transgenico allo stadio di sviluppo desiderato.
Il sistema nervoso enterico del tratto gastrointestinale comprende neuroni enterici e neuroni colinergici che esprimono colina acetiltransferasi.
Questi neuroni colinergici esprimono anche una proteina fluorescente guidata dal promotore della colina acetiltransferasi.
Incubare il tratto con un detergente non ionico e proteine per permeabilizzare le cellule e prevenire il legame con anticorpi non specifici.
Sostituire con anticorpi primari. Incubare gli anticorpi per legare le loro proteine bersaglio nei neuroni, rispettivamente.
Rimuovere gli anticorpi non legati e lavare con tampone.
Incubare con anticorpi secondari coniugati con fluorofori per legare in modo specifico gli anticorpi primari legati alle proteine bersaglio.
Rimuovere gli anticorpi in eccesso e lavare con tampone.
Immergere il tratto marcato in un terreno di montaggio contenente un colorante nucleare per colorare i nuclei. Ora, monta un vetrino coprioggetti.
Utilizzando la microscopia confocale, visualizza e analizza la distribuzione dei neuroni colinergici nel tratto gastrointestinale.
Posizionare i tratti gastrointestinali in una provetta da 0,2 millilitri contenente una soluzione bloccante, composta da 1x PBS, 3% di albumina sierica bovina, 0,1 Triton X-100 e roccia per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo il blocco, aspirare la soluzione bloccante con una pipetta Pasteur a punta fine e sostituirla con la diluizione ottimale degli anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante.
Incubare per quattro ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 gradi Celsius sulla piattaforma a dondolo. Dopo l'incubazione dell'anticorpo primario, aspirare la soluzione anticorpale e sciacquare i tratti gastrointestinali in PBS tre volte per cinque minuti ciascuno, quindi per un'ora a temperatura ambiente con oscillazione.
Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il PBS con anticorpi secondari coniugati con fluorofori diluiti in soluzione bloccante e posizionare i tubi sulla piattaforma oscillante al buio per quattro ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 gradi Celsius.
Dopo aver lavato i tratti gastrointestinali come prima, posizionare alcune gocce di terreno di montaggio a fluorescenza con DAPI su un vetrino, quindi immergere il tratto gastrointestinale nel mezzo di montaggio e aggiungere un vetro di copertura. Infine, acquisisci le immagini di ciascun fluoroforo utilizzando un microscopio confocale, quindi esegui l'analisi delle immagini assistita da computer utilizzando il software appropriato.
Questo articolo descrive un metodo per visualizzare i neuroni colinergici nel sistema nervoso enterico di topi transgenici embrionali. La tecnica prevede una colorazione mediante immunofluorescenza e l'uso della microscopia confocale per analizzare la distribuzione di questi neuroni nel tratto gastrointestinale.
La colorazione immunofluorescente delle popolazioni neuronali nel tratto gastrointestinale murino embrionale permette una visualizzazione precisa e la quantificazione dei sottotipi di neuroni enterici durante lo sviluppo. Questa capacità supporta i team di scoperta precoce nella validazione di target neuronali e nella comprensione dei percorsi di sviluppo rilevanti per i disturbi gastrointestinali. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nei modelli di malattia e orienta le decisioni di portafoglio basate sulla valutazione del rischio per i programmi di neurogastroenterologia.
Questo protocollo di immunofluorescenza si inserisce nel percorso continuo che va dalla scoperta iniziale alla fase preclinica, sostenendo sia la validazione del bersaglio sia la ricerca traslazionale nelle neuroscienze enteriche.
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Ultimo aggiornamento: 22 agosto 2026