JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:58 min. • July 8th, 2025
Prendi un tratto gastrointestinale di topo embrionale fisso e transgenico allo stadio di sviluppo desiderato.
Il sistema nervoso enterico del tratto gastrointestinale comprende neuroni enterici e neuroni colinergici che esprimono colina acetiltransferasi.
Questi neuroni colinergici esprimono anche una proteina fluorescente guidata dal promotore della colina acetiltransferasi.
Incubare il tratto con un detergente non ionico e proteine per permeabilizzare le cellule e prevenire il legame con anticorpi non specifici.
Sostituire con anticorpi primari. Incubare gli anticorpi per legare le loro proteine bersaglio nei neuroni, rispettivamente.
Rimuovere gli anticorpi non legati e lavare con tampone.
Incubare con anticorpi secondari coniugati con fluorofori per legare in modo specifico gli anticorpi primari legati alle proteine bersaglio.
Rimuovere gli anticorpi in eccesso e lavare con tampone.
Immergere il tratto marcato in un terreno di montaggio contenente un colorante nucleare per colorare i nuclei. Ora, monta un vetrino coprioggetti.
Utilizzando la microscopia confocale, visualizza e analizza la distribuzione dei neuroni colinergici nel tratto gastrointestinale.
Posizionare i tratti gastrointestinali in una provetta da 0,2 millilitri contenente una soluzione bloccante, composta da 1x PBS, 3% di albumina sierica bovina, 0,1 Triton X-100 e roccia per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo il blocco, aspirare la soluzione bloccante con una pipetta Pasteur a punta fine e sostituirla con la diluizione ottimale degli anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante.
Incubare per quattro ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 gradi Celsius sulla piattaforma a dondolo. Dopo l'incubazione dell'anticorpo primario, aspirare la soluzione anticorpale e sciacquare i tratti gastrointestinali in PBS tre volte per cinque minuti ciascuno, quindi per un'ora a temperatura ambiente con oscillazione.
Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il PBS con anticorpi secondari coniugati con fluorofori diluiti in soluzione bloccante e posizionare i tubi sulla piattaforma oscillante al buio per quattro ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 gradi Celsius.
Dopo aver lavato i tratti gastrointestinali come prima, posizionare alcune gocce di terreno di montaggio a fluorescenza con DAPI su un vetrino, quindi immergere il tratto gastrointestinale nel mezzo di montaggio e aggiungere un vetro di copertura. Infine, acquisisci le immagini di ciascun fluoroforo utilizzando un microscopio confocale, quindi esegui l'analisi delle immagini assistita da computer utilizzando il software appropriato.