Un'iniezione di vettore virale nella substantia nigra del ratto per la modellazione della malattia neurodegenerativa

Fissare un ratto anestetizzato in una cornice stereotassica.

Disinfettare il cuoio capelluto e praticare un'incisione della linea mediana cranica per esporre il cranio.

Identificare il bregma e il lambda, due punti di riferimento sul cranio, per determinare il sito di iniezione.

Preparare una siringa per microiniezione contenente una sospensione di vettore virale.

Il vettore virale trasporta un transgene che codifica per l'alfa-sinucleina, una proteina che subisce un misfolding e un'aggregazione nei neuroni della substantia nigra nelle malattie neurodegenerative.

Posizionare la siringa nello strumento stereotassico collegato a una pompa per microiniezione.

Creare un foro di bava nel sito di iniezione, evitando lesioni cerebrali.

Penetrare la dura madre con un ago e pulire il sangue con un fazzoletto sterile.

Inserire l'ago per microiniezione attraverso il foro della fresa per raggiungere la substantia nigra.

Iniettare lentamente la sospensione virale, assicurando una distribuzione uniforme.

Fare una breve pausa per evitare il riflusso, quindi ritirare lentamente l'ago.

Sutura l'incisione.

Il modello è ora pronto per ulteriori analisi.

Inizia, anestetizzando adeguatamente una femmina di ratto Wistar di otto settimane secondo i protocolli approvati. Verificare che sia stato realizzato un piano chirurgico di anestesia stringendo ogni zampa e notando l'assenza del riflesso di ritiro. Quindi, usa un impiantatore di microtransponder per posizionare un microtransponder sul retro del ratto. Verificare che il microtransponder sia posizionato correttamente e che sia possibile ottenere una lettura.

Ora taglia i capelli sul cuoio capelluto del ratto e applica l'anestetico locale sul cuoio capelluto e sulle orecchie. Trasferire il ratto in una cappa a flusso laminare ed eseguire il resto della procedura utilizzando una tecnica asettica. Posiziona il ratto nel telaio stereotassico fissando le barre auricolari, seguite dalla barra della bocca e del naso. Copri il corpo del ratto con una coperta di carta per evitare un calo della temperatura corporea. Applicare un lubrificante oculare per evitare che gli occhi si secchino.

Successivamente, disinfettare il cuoio capelluto secondo le procedure approvate. Qui viene utilizzato l'1% di iodio e il 70% di isopropanolo. Dopo aver praticato una piccola incisione nella linea mediana del cuoio capelluto, raschiare delicatamente le membrane del cranio e risciacquare con soluzione fisiologica. Dopo aver lasciato asciugare il cranio, assicurati che bregma e lambda possano essere visti chiaramente.

A questo punto, riempire una siringa per microiniezione da 10 microlitri, calibro 30 da 20 millimetri con AAV ricombinante e posizionarla sulla pompa di microiniezione motorizzata collegata allo strumento stereotassico.

Per la trasduzione specifica dei neuroni dopaminergici della substantia nigra, i vettori AAV ricombinanti sono la prima scelta a causa dei loro alti titoli e dell'efficienza nella trasduzione dei neuroni dopaminergici.

Testare il flusso rilasciando una goccia di AAV. Smaltire l'AAV rilasciato in un detergente polivalente. Controllare visivamente che la testa sia fissata diritta nel telaio della testa. Quindi controlla che il cranio sia piatto spostando prima la punta dell'ago verso il bregma, e misurando l'altezza a questo punto abbassando la punta dell'ago in direzione dorso-ventrale, fino a toccare il cranio. Ripetere la procedura in lambda.

Dopo aver riportato l'ago a bregma, spostare l'ago in direzione anteroposteriore e mediolaterale verso le coordinate stereotassiche per la microiniezione. Annota le coordinate. Nel sito di iniezione, misurare l'altezza del cranio come prima e assicurarsi che non differisca di più di 0,3 millimetri dall'altezza del bregma.

Quindi praticare con cura un foro di 2 millimetri nel cranio. Una volta praticato il foro, misurare l'altezza della dura madre per determinare il riferimento da cui applicare la coordinata dorso-ventrale. Penetrare la dura madre utilizzando un ago calibro 26. Assorbire il sangue con un fazzoletto sterile e procedere solo dopo che tutto il sanguinamento si è fermato.

Ora abbassa lentamente l'ago della siringa per microiniezione precaricata nel cervello fino alla coordinata ventrale dorsale e fai una pausa di un minuto. Quindi iniettare tre microlitri di AAV a una velocità di 0,25 microlitri al minuto. Dopo l'iniezione, lasciare che l'ago rimanga in posizione per altri cinque minuti per evitare il riflusso lungo la traccia dell'ago prima di rimuoverlo lentamente.

Cucire il cuoio capelluto utilizzando poliestere intrecciato rivestito 3.0 e disinfettare la pelle con l'1% di iodio in isopropanolo al 70%, per allentare il naso e la barra della bocca, e poi le due barre auricolari per rimuovere delicatamente l'animale dallo strumento stereotassico. A questo punto, somministrare analgesia e, se necessario, un agente di inversione dell'anestesia. Quindi, metti il ratto in una gabbia pulita su una piastra riscaldante impostata a 38 gradi Celsius e monitora attentamente fino a quando non si sveglia.