Isolamento di aggregati proteici insolubili con detergenti da tessuto cerebrale umano post-mortem

Inizia con un campione di tessuto cerebrale umano congelato post-mortem proveniente da un caso confermato di malattia neurodegenerativa.

Materia grigia ad accisa ricca di aggregati proteici insolubili, segno distintivo della malattia.

Trasferire il fazzoletto in un omogeneizzatore.

Aggiungere un tampone contenente inibitori e omogeneizzare per rilasciare componenti intracellulari.

Gli inibitori bloccano gli enzimi proteasi e fosfatasi, prevenendo la degradazione delle proteine.

Trasferire l'omogeneizzato in un tubo e aggiungere un tampone detergente ionico. Incubare.

Il detergente solubilizza le proteine ripiegate in modo nativo, mentre gli aggregati proteici mal ripiegati rimangono intatti.

Sonicare per completare la dissociazione cellulare.

Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da ultracentrifuga e centrifugare ad alta velocità.

Gli aggregati si depositano sul fondo.

Rimuovere il surnatante contenente proteine solubili in detergenti.

Lavare gli aggregati con un tampone detergente ionico, centrifugare e rimuovere il surnatante.

Aggiungere un tampone di urea per denaturare gli aggregati proteici, rendendoli solubili.

Trasferire gli aggregati proteici solubilizzati in una provetta e sonicare brevemente per garantire la completa dissoluzione.

Ottenere tessuto cerebrale post-mortem congelato da un controllo sano e da un AD patologicamente confermato. Utilizzare una pinza e una lama di rasoio per asportare circa 250 milligrammi di materia grigia da ciascun campione di tessuto. Lasciare scongelare il segmento cerebrale per un minuto. Ora, taglia un pezzo di tessuto in pezzi cubizzati di circa due millimetri mentre si scongela. Trasferire in un tubo di omogeneizzatore dounce pre-raffreddato da due millilitri con ghiaccio.

Ricorda di evitare la sostanza bianca e i grandi vasi sanguigni.

Lavorare velocemente e posizionare il fazzoletto su pese monouso a strappo. Fare attenzione a prevenire lo scongelamento del tessuto posizionando frequentemente la navicella di pesatura con il tessuto cerebrale in contenitori di polistirolo con ghiaccio secco. Dopo aver sezionato e pesato tutti i pezzi di tessuto necessari, rimuovere dal ghiaccio secco una navicella di pesatura contenente un pezzo di tessuto.

Quindi, aggiungere cinque millilitri di tampone a basso contenuto di sale ghiacciato con proteasi e cocktail di inibitori della fosfatasi per grammo di tessuto e omogeneizzare con ghiaccio utilizzando circa 10 colpi di pestello A ad alta distanza e 15 colpi di pestello B a bassa distanza. Quindi, utilizzare una pipetta Pasteur in vetro da nove pollici per trasferire ciascun omogeneizzato in una provetta di polipropilene da due millilitri etichettata. Aliquotare l'omogeneizzato rimanente in ulteriori provette da 1,5 millilitri etichettate in modo simile per la conservazione a -80 gradi Celsius.

Per procedere con il frazionamento, aggiungere 100 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari e 100 microlitri di Sarkosyl al 10% a ciascuna aliquota di 0,8 millimetri. Mescolare bene per inversione, quindi incubare con ghiaccio per 15 minuti. Dopo l'incubazione, utilizzare un sonicatore dotato di una sonda a micropunta per erogare tre impulsi di 5 secondi al 30% di ampiezza.

Dopo aver utilizzato il metodo dell'acido bicinchoninico per determinare le concentrazioni proteiche degli omogeneizzati, aggiungere un tampone sark ghiacciato con inibitori della proteasi e della fosfatasi a ciascun campione fino a una concentrazione finale di 10 milligrammi per millimetro. Quindi, trasferire 500 microlitri di ciascun campione in provette per ultracentrifuga in policarbonato da 500 microlitri.

Caricare le provette in un rotore pre-raffreddato e ultracentrifugare a 180.000 volte g per 30 minuti a 4 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, trasferire i surnatanti solubili S1 sarkosil in provette da 1,5 millilitri e conservare a -80 gradi Celsius. Aggiungere 200 microlitri di tampone sark alle provette per ultracentrifuga contenenti le frazioni P1 insolubili nel detergente e utilizzare la punta della pipetta per rimuovere i pellet dal fondo delle provette per ultracentrifuga.

Quindi, trasferire i pellet P1 risospesi in nuove provette per ultracentrifuga da 500 microlitri, accoppiare il bilanciamento e centrifugare a 180.000 volte g per altri 30 minuti a 4 gradi Celsius. Scartare il surnatante S2, quindi aggiungere da 50 a 75 microlitri di tampone ureico con proteasi e cocktail di inibitori della fosfatasi ai pellet insolubili di sarkosil e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per solubilizzare il pellet P2.

Dopo l'incubazione, trasferire i pellet di P2 risospesi in provette da 0,5 millimetri etichettate e solubilizzare completamente i pellet utilizzando una breve sonicazione con micropunta di 1 secondo al 20% di ampiezza. Determinare le concentrazioni proteiche delle frazioni sarkosil solubili e sarkosil insolubili utilizzando il metodo del saggio BCA.