JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 1:58 min. • July 8th, 2025
Inizia con una piastra multipozzetto contenente una barriera emato-encefalica in vitro o un modello BEE.
Questo modello è costituito da cellule endoteliali aderenti al lato superiore o sanguigno e astrociti sul lato inferiore o cerebrale di un inserto di membrana rivestito di matrice.
Aggiungere l'isotiocianato di fluoresceina o FITC, un colorante fluorescente, nella camera superiore di un pozzetto di controllo.
Al contrario, aggiungere ferritina caricata con FITC, o ferritina FITC, alla camera superiore di un pozzetto per campioni e quindi incubare.
Nel pozzetto di controllo, il FITC libero rimane confinato nella camera superiore, con un attraversamento minimo attraverso la BBB.
Nel frattempo, nel pozzetto del campione, i complessi FITC-ferritina si legano ai recettori sulle cellule endoteliali.
Ciò consente l'internalizzazione mediata dal recettore e il trasporto nella camera inferiore.
Successivamente, raccogliere regolarmente il terreno dalle camere inferiori di entrambi i pozzetti e misurare l'intensità della fluorescenza.
Il controllo mostra una fluorescenza inferiore, mentre il campione mostra una fluorescenza più elevata, confermando la permeabilità differenziale della BBB per FITC e FITC-ferritina.
Per misurare il flusso di ferritina FITC attraverso il sistema di barriera emato-encefalica, aggiungere ferritina caricata con FITC o FITC libero alla parte superiore di almeno tre sistemi di barriera emato-encefalica per ciascuna formulazione.
Dopo sette ore in un'incubatrice, prelevare 2 millilitri di terreno dalle camere inferiori di tre inserti per campioni e controlli. Misurare l'intensità di fluorescenza di 500 microlitri dei campioni raccolti mediante spettrofluorimetro e determinare la concentrazione di FITC permeato o FITC-ferritina secondo le istruzioni nella parte scritta del protocollo.