JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 1:59 min. • July 8th, 2025
Inizia con un cucciolo di topo geneticamente modificato portatore del gene CCM2, che è essenziale per la stabilità dei vasi sanguigni.
Questo gene è affiancato da due siti loxP. Le cellule endoteliali del cucciolo esprimono anche l'enzima Cre ricombinasi fuso con un recettore degli estrogeni o ER.
Iniettare intragastricamente 4-idrossitamoxifene o 4-HT nel cucciolo.
La 4-HT si diffonde attraverso le cellule endoteliali e si lega alla porzione del recettore degli estrogeni della proteina di fusione Cre-ER.
Questo legame innesca un cambiamento conformazionale che attiva la Cre ricombinasi, che entra nel nucleo delle cellule endoteliali e si lega ai siti loxP.
Ciò facilita l'evento di ricombinazione tra i siti loxP, formando un loop e asportando il segmento genico CCM2.
La perdita di CCM2 interrompe l'integrità delle cellule endoteliali, compromettendo la stabilità delle pareti dei vasi sanguigni.
Ciò porta allo sviluppo di strutture vascolari anomale gonfie note come malformazioni cavernose cerebrali o CCM, che sono fragili e soggette a perdite.
Iniziare sciogliendo la 4-HT in etanolo al 100% fino a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro. Preparare aliquote da 30 microlitri e poi conservare a meno 80 gradi Celsius. Il giorno dell'uso, diluire il 4-HT aliquotato in olio di mais a 0,5 milligrammi per millilitro. Quindi, utilizzare una siringa da insulina per iniettare intragastricamente 50 microlitri di 4-HT nei cuccioli neonatali P1 per indurre lesioni sperimentali CCM.