Studio dell'accumulo di alfa-sinucleina nei neuroni della dopamina embrionale primaria di topo

Prendere colture di micro-isole di neuroni dopaminergici embrionali primari di topo in una piastra a più pozzetti contenente terreni.

Questi neuroni sono pre-trattati con fibrille preformate (PFF), forme mal ripiegate e aggregate della proteina alfa-sinucleina.

I PFF agiscono come semi, innescando un ulteriore misfolding e oligomerizzazione dell'alfa-sinucleina endogena, formando fibrille di alfa-sinucleina fosforilata. Queste fibrille alla fine formano corpi di Lewy.

Sostituire il terreno con un fissativo per preservare la morfologia cellulare.

Lavare le celle con tampone.

Introdurre un tampone contenente detergente per permeabilizzare le membrane cellulari.

Aggiungere una soluzione bloccante per prevenire il legame di anticorpi non specifici.

Aggiungere anticorpi primari che hanno come bersaglio l'alfa-sinucleina fosforilata e una proteina di riferimento espressa ubiquitariamente nei neuroni dopaminergici.

Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati.

Introdurre anticorpi secondari coniugati con fluorofori che hanno come bersaglio i rispettivi anticorpi primari.

Lavare di nuovo per rimuovere gli anticorpi non legati.

Aggiungi un colorante legante il DNA per colorare i nuclei.

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