Immunocolorazione degli interneuroni in una sezione ippocampale di ratto

Prendiamo una sezione ippocampale fissa di ratto contenente un interneurone riempito di biocitina, una molecola coniugata con biotina.

Successivamente, aggiungi una soluzione contenente proteine bloccanti e un detergente non ionico per prevenire il legame non specifico e permeabilizzare i neuroni.

Incubare con un anticorpo primario che ha come bersaglio specifici recettori dei cannabinoidi sugli interneuroni.

Lavare con tampone per rimuovere gli anticorpi in eccesso.

Quindi, aggiungere un colorante fluorescente coniugato con streptavidina e un anticorpo secondario coniugato con fluoroforo.

Durante l'incubazione, la streptavidina si lega fortemente alla biocitina, consentendo la visualizzazione dell'interneurone pieno di biocitina, mentre l'anticorpo secondario prende di mira gli anticorpi primari legati al recettore sugli interneuroni.

Risciacquare con tampone, rimuovendo le molecole non legate.

A questo punto, montare la sezione utilizzando un mezzo di montaggio acquoso. Posizionare un vetrino coprioggetti e sigillarlo.

Utilizzando un microscopio a fluorescenza, visualizza l'espressione dell'interneurone pieno di biocitina e del recettore dei cannabinoidi, consentendo l'analisi della morfologia e della distribuzione dei recettori dell'interneurone.

Bloccare i fazzoletti con siero bloccante al 10% per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, incubare le sezioni dell'anticorpo primario CB1R a temperatura ambiente durante la notte, per identificare l'espressione del recettore dei cannabinoidi di tipo uno. Quindi, lavare le sezioni cerebrali tre volte per 10 minuti ciascuna in PBS 0,1 molari. La streptavidina e l'anticorpo secondario contro il primo anticorpo primario vengono entrambi aggiunti alla piastra a pozzetti e mantenuti per una notte a quattro gradi Celsius.

Successivamente, incubare le sezioni nel colorante rosso streptavidina coniugato a quattro gradi Celsius durante la notte al buio per rivelare la biocitina. Successivamente, lavare le sezioni cerebrali tre volte per 10 minuti ciascuna in PBS 0,1 molari. Per proteggere la fluorescenza e facilitare la ricolorazione in futuro, montare le sezioni in un mezzo di montaggio a base acquosa e sigillare i bordi dei vetrini coprioggetti con smalto trasparente.