Induzione di una lesione neuronale mirata utilizzando un laser ad alta potenza in una larva di Drosophila

Posizionare una larva di Drosophila anestetizzata con la testa rivolta verso l'alto su una goccia d'olio su un vetrino contenente macchie di grasso sottovuoto.

Posiziona un vetrino coprioggetti e premilo delicatamente per entrare in contatto con la larva.

Regolare la larva per esporre la regione contenente i neuroni bersaglio che esprimono proteine fluorescenti.

Fissare il vetrino su un microscopio a due fotoni.

Usa un laser a bassa potenza per ridurre al minimo i danni e scansiona la larva per localizzare la regione con i neuroni bersaglio fluorescenti.

Quindi, regolare la finestra di scansione per concentrarsi sulla regione target contenente gli assoni, un tipo di proiezioni neuronali.

Ora, riduci la velocità di scansione e aumenta la potenza del laser.

Il laser ad alta potenza colpirà gli assoni mirati, generando calore localizzato che li danneggia e migliora la fluorescenza intorno al sito della lesione.

Infine, torna alla modalità laser a bassa potenza. La presenza di piccole strutture ad anello nel sito della lesione conferma il successo del danno neuronale.

Inizia con l'anestetizzazione delle larve. In una cappa aspirante, posizionare una capsula di vetro da 60 millimetri in una capsula di Petri di plastica da 15 centimetri. Quindi, piega un pezzo di carta velina e mettilo nella pirofila di vetro. Posizionare la piastra di agar d'uva sul tessuto dopo aver aggiunto l'etere dietilico. Quindi, su un vetrino, posizionare una goccia di olio alocarbonico 27 al centro e posizionare una macchia di grasso sottovuoto su ciascuno dei quattro angoli.

Quindi, usa una pinza per trasferire una larva sulla piastra di agar e copri il piatto di vetro per anestetizzare la larva. Non appena la larva smette di muoversi, trasferiscila con cura nell'olio di alocarburi con la testa in posizione verticale. Quindi, posiziona un vetrino coprioggetti sul vetrino e premilo delicatamente verso il basso, fino a toccare la larva. Quindi, usa una forza delicata per far scorrere il vetrino coprioggetti per far rotolare le cellule da ablare dove il laser a due fotoni le colpirà più facilmente. La posizione varierà a seconda dei neuroni presi di mira.

Ora, fissare il gruppo sul tavolino del microscopio a due fotoni e mettere a fuoco le celle di interesse utilizzando un obiettivo a immersione in olio 40x. Nel software, passare alla modalità di scansione e caricare il protocollo salvato. Assicurati che il foro stenopeico sia completamente aperto. Quindi, in modalità Live, ottieni una buona immagine della regione di interesse. Quindi, interrompi la scansione in tempo reale, in modo che il pulsante Ritaglia diventi disponibile. Utilizzando la funzione Ritaglia, regolare la finestra di scansione per focalizzare l'area target solo sul potenziale sito della lesione.

Quindi apri una nuova finestra di imaging. Ora, riduci la velocità di scansione e aumenta l'intensità del laser. Quindi attiva o disattiva il pulsante continuo per avviare e interrompere la scansione. Guarda attentamente. Non appena si verifica un drastico aumento della fluorescenza, terminare la scansione. Quindi, torna alla finestra di imaging originale, seleziona la modalità Live e trova la regione che è stata appena presa di mira regolando la messa a fuoco.

Una buona indicazione di una lesione riuscita è la comparsa di un piccolo cratere, una struttura ad anello o detriti localizzati proprio sul sito della lesione. Se la potenza del laser fosse troppo alta, sarebbe visibile un'ampia area di danno, che può essere letale.