JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:19 min. • July 8th, 2025
Inizia con una coltura aderente di neuroni umani maturi in una piastra rivestita di matrice.
Aggiungere vettori lentivirali che codificano una proteina tau umana mutante fusa con un reporter di proteina fluorescente gialla (YFP).
Il lentivirus si lega a specifici recettori della superficie cellulare neuronale, consentendo la fusione della membrana virale-ospite e il rilascio di RNA virale ed enzimi.
L'RNA virale viene trascritto inversamente in DNA.
L'integrasi virale trasporta il DNA nel nucleo, facilitando l'integrazione nel genoma ospite e portando alla produzione della proteina tau mutante marcata con YFP.
Nel corso del tempo, la tau mutante forma aggregati citoplasmatici nelle cellule trasdotte.
Lavare le cellule con terreno fresco per rimuovere le particelle virali non internalizzate.
Continuare l'incubazione con regolari cambi di terreno per mantenere la vitalità neuronale e promuovere l'aggregazione proteica.
Visualizza i neuroni al microscopio.
I neuroni trasdotti con successo mostrano aggregati citoplasmatici di proteina tau mutante fluorescente marcata con YFP.
Per trasdurre i neuroni con lentivirus, utilizzare un titolo di 340.000 unità trasducibili per cellula. Diluire le unità trasducibili nei terreni di coltura cellulare alla concentrazione necessaria e aggiungerle alle cellule.
Due giorni dopo l'aggiunta del lentivirus, lavare le cellule una volta con un terreno fresco che non contenga bFGF.
Continuare a coltivare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica in terreni senza bFGF. Mantenere le cellule per circa otto settimane dopo la trasduzione, assicurandosi di cambiare i terreni di coltura cellulare a giorni alterni. Usa un microscopio ottico per visualizzare regolarmente le cellule e garantirne la vitalità.