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Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:59 min. • July 8th, 2025
Inizia con cellule umane geneticamente modificate in un terreno di coltura.
Queste cellule contengono un sistema inducibile dalla tetraciclina che possiede la proteina precursore dell'amiloide o gene APP e un gene della luciferasi.
Scambiare con un terreno contenente tetraciclina e incubare.
La tetraciclina si lega alla proteina attivatrice, che si lega al promotore dell'APP.
Questo induce l'espressione genica e produce le proteine precursori che si localizzano sulla membrana cellulare.
L'enzima β-secretasi scinde l'APP, generando un frammento che rimane attaccato alla membrana cellulare.
La γ-secretasi scinde questo frammento, producendo peptidi amiloidi-β e rilasciando un componente attivatore.
Questo attivatore entra nel nucleo, si lega al promotore della luciferasi, induce l'espressione genica e produce enzimi luciferasi.
Sostituire il terreno con un reagente per saggi contenente il substrato della luciferasi. Il substrato si diffonde nelle cellule e reagisce con la luciferasi, producendo bioluminescenza.
Utilizzare un lettore di micropiastre per misurare l'intensità della luce, che riflette direttamente l'attività della γ-secretasi, un enzima cruciale nelle condizioni neuropatologiche.
Contare le cellule NG o CG con un emocitometro. Quindi, seminare le cellule a 20.000 cellule per pozzetto su micropiastre da 96 pozzetti a un volume finale di 200 microlitri per pozzetto in terreno di crescita. Trasferire le micropiastre in un incubatore ad anidride carbonica umidificato e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione notturna, rimuovere 100 microlitri di terreno di coltura da ciascun pozzetto.
Aggiungere 100 microlitri per pozzetto di terreno di crescita contenente 2 microgrammi per millilitro di tetraciclina con dimetilsolfossido allo 0,2%, due micromolari CL 387, 785, due micromolari DAPT o altri inibitori ErbB1/ErbB2 correlati. Incubare le cellule trattate in micropiastre a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere 150 microlitri per pozzetto di terreno di coltura dalle micropiastre.
Quindi aggiungere 50 microlitri per pozzetto di reagente per il dosaggio della luciferasi. Successivamente, trasferire le micropiastre in un lettore di micropiastre a luminescenza e mantenerle a temperatura ambiente per cinque minuti. Determinare la luminescenza emessa dalla luciferasi della lucciola utilizzando un programma predefinito memorizzato nel lettore di micropiastre di luminescenza.