Saggio della luciferasi per misurare l'attività della γ-secretasi nelle cellule umane

Inizia con cellule umane geneticamente modificate in un terreno di coltura.

Queste cellule contengono un sistema inducibile dalla tetraciclina che possiede la proteina precursore dell'amiloide o gene APP e un gene della luciferasi.

Scambiare con un terreno contenente tetraciclina e incubare.

La tetraciclina si lega alla proteina attivatrice, che si lega al promotore dell'APP.

Questo induce l'espressione genica e produce le proteine precursori che si localizzano sulla membrana cellulare.

L'enzima β-secretasi scinde l'APP, generando un frammento che rimane attaccato alla membrana cellulare.

La γ-secretasi scinde questo frammento, producendo peptidi amiloidi-β e rilasciando un componente attivatore.

Questo attivatore entra nel nucleo, si lega al promotore della luciferasi, induce l'espressione genica e produce enzimi luciferasi.

Sostituire il terreno con un reagente per saggi contenente il substrato della luciferasi. Il substrato si diffonde nelle cellule e reagisce con la luciferasi, producendo bioluminescenza.

Utilizzare un lettore di micropiastre per misurare l'intensità della luce, che riflette direttamente l'attività della γ-secretasi, un enzima cruciale nelle condizioni neuropat