Modello di invasione tumorale basato su matrice utilizzando la co-coltura del glioblastoma della microglia

Inizia aggiungendo una sospensione fredda di glioblastoma e cellule microgliali, ciascuna colorata con un colorante fluorescente distinto, in una soluzione di matrice polimerica fredda.

La condizione di freddo impedisce la polimerizzazione prematura della matrice.

Quindi, trasferire la miscela in un inserto a camera porosa all'interno di una piastra di coltura.

Incubare per consentire la polimerizzazione della matrice, formando un gel che incorpora le cellule.

Aggiungere il terreno privo di siero all'inserto e il terreno di coltura contenente siero al pozzetto sottostante, quindi incubare.

I fattori chimici nel siero promuovono la migrazione cellulare verso i terreni ricchi di siero.

Inoltre, le microglia secernono molecole di segnalazione che interagiscono con le cellule di glioblastoma.

Ciò migliora la migrazione delle cellule di glioblastoma verso la parte inferiore dell'inserto poroso, simile alla loro migrazione da un tumore al tessuto circostante.

Rimuovere le celle dalla parte superiore della camera.

Ora, fissare le cellule rimanenti con un fissativo e lavarle con un tampone. La distinta fluorescenza delle cellule aiuta a tracciare la migrazione cellulare.

Scongelare la miscela di matrice a quattro gradi Celsius durante la notte. Quindi, preparare una concentrazione di matrice di 10 mg/ml nell'apposito terreno su ghiaccio. Quindi, raccogliere le cellule marcate per la sospensione nella matrice come mostrato in precedenza. Quindi, pipettare 1,5 volte 10 per le quinte cellule GL261 in un volume di 150 microlitri, più cinque volte 10 per le quarte cellule microglia in 50 microlitri in una provetta per microfuge da 1,5 millilitri.

Aggiungere 2 volte 10 alla quinta cella GL261 in un volume di 200 microlitri in una provetta per microfuge separata da 1,5 millilitri. Far girare le cellule in una microfuga per cinque minuti a 120 volte g. Quindi, risospendere le cellule in 200 microlitri di matrice fredda su ghiaccio.

Per questo passaggio, è fondamentale avere la vaschetta del ghiaccio pronta nella cappa. Conservare i tubi sulle punte del ghiaccio in frigorifero. Assicurati che tutto sia raffreddato per evitare la polimerizzazione prematura del gel maturo.

Dopo la risospensione, piastrate 50.000 cellule in un volume di 50 microlitri al centro del compartimento superiore di un inserto della camera dei pori di 8 micron. Quindi, incubarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti per consentire la polimerizzazione. Dopo 30 minuti, aggiungere 200 microlitri di terreno privo di siero nella camera superiore e 700 microlitri di siero contenente terreno di crescita cellulare nel pozzetto inferiore.

Dopo l'incubazione per 48 ore, rimuovere le cellule dalla parte superiore della camera mediante aspirazione delicata. Fissare le camere come prima e sostituire il fissativo con 500 microlitri di PBS 1X prima di eseguire l'imaging delle cellule.