Studio della trasmigrazione dei linfociti attraverso un monostrato di cellule endoteliali microvascolari

Prelevare una micropiastra con inserti transwell rivestiti con proteine ECM per promuovere l'adesione cellulare.

Aggiungere le cellule endoteliali microvascolari del cervello umano, o HBMEC, negli inserti e un mezzo di crescita nei compartimenti inferiori.

Incubare, permettendo alle cellule di aderire e crescere in un monostrato. Queste cellule esprimono giunzioni strette, imitando l'endotelio della barriera emato-encefalica che limita il passaggio di cellule e molecole.

Rimuovere il mezzo. Aggiungere cellule mononucleate del sangue periferico, o PBMC, agli inserti e un terreno di coltura ai compartimenti inferiori.

Incubare, consentendo ai linfociti PBMC di interagire con le cellule endoteliali e quindi passare tra di loro, un processo chiamato trasmigrazione.

Sciacquare il fondo dell'inserto, raccogliendo le cellule trasmigrate aderenti negli scomparti inferiori.

Introdurre le microsfere fluorescenti come riferimento per la quantificazione cellulare.

Trasferire la sospensione in una provetta, centrifugare, scartare il surnatante e risospendere in un cocktail di anticorpi coniugati con fluorofori per marcare i linfociti.

I linfociti trasmigrati sono pronti per la quantificazione tramite citometria a flusso.

Per preparare gli inserti di coltura cellulare per un test di trasmigrazione, aggiungere prima 100 microlitri di soluzione di fibronectina a ciascun inserto e a un pozzetto di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Dopo tre ore a 37 gradi Celsius, sostituire la soluzione di fibronectina con 100 microlitri di HBMEC e aggiungere 600 microlitri di terreno ECM-b fresco nei compartimenti inferiori degli inserti di coltura cellulare.

Quindi, rimetti le piastre nell'incubatore per colture cellulari per tre o quattro giorni. Risospendere la cellula mononucleata del sangue periferico, o campione di PBMC, a una concentrazione da 5 volte 10 a 6 cellule per millilitro in terreno RPMI integrato con B27. Quindi, aspirare il terreno dai compartimenti inferiore e superiore del numero appropriato di inserti per colture cellulari contenenti i monostrati HBMEC confluenti e aggiungere 100 microlitri di PBMC per donatore agli inserti per colture cellulari e a un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti per controllo in vitro.

Aggiungere 600 microlitri di RPMI più B27 agli scomparti inferiori degli inserti per colture cellulari e 500 microlitri ai pozzetti di controllo in vitro e rimettere le piastre nell'incubatore per colture cellulari per sei ore. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pinza per rimuovere gli inserti di coltura cellulare, sciacquando accuratamente i fondi con 400 microlitri di PBS senza toccare le membrane.

Quindi, miscelare accuratamente 20 microlitri di fluorosfere a flusso con le cellule nei pozzetti di controllo sperimentali e in vitro e trasferire 1 millilitro delle sospensioni di PBMC risultanti nelle provette di citometria a flusso corrispondenti appropriate. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e aggiungere gli anticorpi coniugati al fluorocromo di interesse in 100 microlitri di tampone per citometria a flusso a ciascun campione. Dopo 30 minuti a 4 gradi Celsius, lavare le cellule con 250 microlitri di tampone fresco per citometria a flusso e risospendere i pellet nel volume appropriato di tampone per citometria a flusso per l'analisi.