JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:10 min • July 8th, 2025
Inizia con un inserto di membrana contenente cellule endoteliali microvascolari cerebrali di topo, simile a una barriera emato-encefalica in vitro.
Posizionare questo inserto in un pozzetto dello strumento a resistenza elettrica transendoteliale o TEER contenente un elettrodo incorporato.
Aggiungere nuovi supporti nello scomparto inferiore.
Posizionare il coperchio con gli elettrodi sui pozzetti TEER, quindi inserire lo strumento in un'incubatrice e collegarlo a un sistema di registrazione.
Gli elettrodi generano una corrente elettrica attraverso lo strato cellulare per la misurazione della resistenza transendoteliale.
Le proteine giunzionali intatte tra le cellule ostacolano il flusso di corrente, con conseguente aumento del valore TEER.
Scollegare lo strumento e rimuoverlo.
Smontare il coperchio, rimuovere un po' di terreno dallo scomparto superiore e aggiungere le cellule T preattivate. Rimontare lo strumento per la misurazione TEER.
Le cellule T attivate interagiscono con le cellule endoteliali, rilasciando fattori infiammatori ed enzimi citolitici, interrompendo l'integrità giunzionale.
Questa interruzione aumenta il flusso di corrente elettrica, con conseguente riduzione del valore TEER.
Per impostare la misura TEER, posizionare il modulo a 24 pozzetti dello strumento TEER nella cappa a flusso laminare. Rimuovere i coperchi e posizionare gli inserti con MBMEC nello strumento utilizzando una pinza.
Quindi, pipettare 810 microlitri di terreno fresco nello scomparto inferiore dei pozzetti del modulo. Aggiungilo con attenzione tra l'inserto e la parete del modulo bene. Successivamente, chiudere i coperchi e posizionare lo strumento nell'incubatrice. Collegare lo strumento al computer. Quindi, accendere il controller dello strumento e aprire il software.
Nella finestra pop-up, seleziona "Nuova misurazione". Seleziona le caselle "Mostra TEER" e "Mostra Ccl", quindi premi "Avvia". Dopo aver completato la prima misurazione, selezionare "Controlla tutti i pozzetti" nella scheda "risultati" per vedere tutti i valori TEER e Ccl. Quindi salva il file.
Successivamente, scegliere il punto temporale per la co-coltura di MBMEC con cellule T quando Ccl è stabile e inferiore a 1 microfarad per centimetro quadrato e TEER ha raggiunto il suo livello massimo. Ispezionare attentamente i valori assoluti di TEER e Ccl ed escludere i pozzi in cui gli MBMEC non hanno sviluppato abbastanza monostrati confluenti deselezionando tali pozzi.
Raggruppa il resto dei pozzetti facendo clic con il pulsante destro del mouse sui pozzetti e selezionando "Aggiungi pozzetto al nuovo pozzetto medio". Assegna un nome alla finestra pop-up e fai lo stesso per tutti i singoli pozzetti da raggruppare. Quindi, controlla tutti i pozzetti medi per confermare che tutti abbiano le stesse condizioni iniziali prima della co-coltura.
Nella scheda "Esperimento", premi "Pausa". Scollegare lo strumento ed estrarlo dall'incubatrice. Quindi, rimuovere i coperchi nella cappa a flusso laminare. Successivamente, rimuovere parte del fluido dall'inserto nello scomparto superiore del pozzetto. Aggiungere le cellule T agli MBMEC pipettando accuratamente 150 microlitri di terreno. Quindi, ricollegare lo strumento e premere 'Riprendi misurazione'. Dopo 24 ore, premi "Stop" nella scheda "Esperimento" e salva il file.